吲哚菁綠-磷酸鈣納米粒的制備與質量評價

王杰，戴俊東，王靜，鞠佳芮，郭鵬川，朱笑顏，姜臨霞（北京中醫藥大學，北京 102488）

吲哚菁綠（ICG）是一種近紅外（NIR）熒光染料，因其光學特性和良好的生物相容性，被美國FDA批準作為造影劑用于臨床熒光成像和光聲成像。同時，ICG 分子能夠吸收近紅外光，將之轉化為熱能和單線態氧，可用于光熱治療（PTT）和光動力治療（PDT）。然而 ICG 的水不穩定性、光降解性、熱降解性和易于與脂蛋白結合導致體內快速被清除（血液半衰期 2～4 min）等，限制了其在腫瘤診療方面的應用[1-3]。近年來，納米技術的快速發展為這一問題的解決提供了技術支持。負載ICG的多功能納米材料在控釋藥物、提高藥物生物穩定性、利用度和增強藥物輸送的靶向性等方面具有諸多優勢，在腫瘤早期診療領域有較大的應用前景[4-5]。

人和動物實體瘤的 pH 數據顯示，正常組織中細胞外pH和血液pH恒定在7.4，超過80%的腫瘤細胞pH低于正常組織，范圍在5.7～7.0[6]。腫瘤細胞內的內涵體和溶酶體具有更強的酸性（pH 4～6）。因此，酸性 pH 被認為是特異性觸發抗腫瘤藥物釋放的理想條件[7]。研究表明，pH敏感型納米載體可通過響應正常組織與腫瘤組織之間微小的pH差異，增強藥物在腫瘤細胞處的靶向特異性，促進納米藥物進入腫瘤細胞，在降低不良反應的同時提高化療藥物的療效。

磷酸鈣納米載藥體系是一種典型的pH響應體系，具有良好的生物相容性和生物可降解性[8]，在生物醫藥領域有著廣泛的應用，包括基因轉染[9]、基因沉默[10]、藥物載體[11-12]、生物成像[13]等方面。磷酸鈣在血液（pH 7.4）中幾乎不溶解，在弱酸性病理環境（pH 5～6）中，則會加速溶解，促進藥物釋放，從而提高靶向部位藥物療效，降低正常組織毒性與不良反應[14]。這些特性使磷酸鈣納米載藥體系成為一種更優良的藥物載體。

本課題擬借鑒腫瘤靶向 pH 敏感納米結構響應機制，制備具有 pH 敏感性的吲哚菁綠-磷酸鈣納米粒（ICG-CaP/NPs），并對其進行質量評價。為 ICG-CaP/NPs 的腫瘤靶向治療，以及經肺給藥對缺血性心臟病的靶向研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA223S-CW電子分析天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；IKA RT10高效10點加熱磁力攪拌器（德國IKA公司）；pH計[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；Sigma 1-6P小型臺式低速離心機（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；ZetaSizer Nano-ZS馬爾文粒徑檢測儀（英國馬爾文儀器有限公司）；Alpha 2-4 LD plus冷凍干燥機（德國Martin Christ儀器有限公司）；JEM-1400 Plus 120kV高襯度透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；756PC型紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

ICG對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥95%）；卵磷脂（上海麥克林生化科技有限公司，純度＞90%）；Mili-Q高純水，無水乙醇、甲醇、無水氯化鈣、十二水合磷酸氫二鈉、二水合檸檬酸鈉、氫氧化鈉、磷酸、正庚烷均為分析純（北京化工廠）。

2 方法

2.1 Box-Behnken響應面法優選ICG-CaP/NPs最佳制備工藝

2.1.1 試驗設計與結果 通過查閱文獻確定以氯化鈣為鈣源，磷酸氫二鈉為磷源，檸檬酸鈉為穩定劑和晶體調節劑，共沉淀法制備吲哚菁綠磷酸鈣納米粒。固定氯化鈣溶液（100 mmol·L－1）與檸檬酸鈉溶液（400 mmol·L－1）各5 mL混合，磷酸氫二鈉濃度120 mmol·L－1。

本試驗以粒徑（粒徑分布在50～100 nm）、載藥量及包封率為評價指標，Ca/P、pH值、ICG加入量為考察因素，基于Box-BehnKen試驗設計建立了3因素3水平的試驗模型，考察ICG-CaP/NPs制備工藝并進行響應面優化分析，試驗設計見表1。

取氯化鈣溶液（100 mmol·L－1）與檸檬酸鈉溶液（400 mmol·L－1）各5 mL混合，攪拌5 min；按表1的設計加入相應ICG和Na2HPO4，反應5 min，0.1 mol·L－1NaOH調對應pH，再攪拌5 min，反應液置于3500 Da纖維素透析袋，500 mL高純水，400 r·min－1透析6 h，透析液凍干，即得ICGCaP/Nps凍干粉。采用Design Expert.V8.0.6.1進行模型擬合，并通過相關系數r2等對擬合模型進行評價，根據回歸方程確定最佳制備工藝。

2.1.2 驗證試驗 按照“2.1.1”項下方法和確定的最佳制備工藝制備ICG-CaP/NPs，平行操作3份，測定其粒徑、載藥量和包封率，進行最佳工藝的驗證試驗。

2.2 最優處方制劑質量評價

2.2.1 微觀形態 取 ICG-CaP/NPs 樣品適量，用Mili-Q 純化水稀釋后，取少量滴至200目銅網上，1～2 min后濾紙吸去多余液體，再向銅網表面滴加1滴2%（w/w）磷鎢酸溶液負染2 min，濾紙吸去多余液體，自然晾干，于透射電子顯微鏡下觀察納米粒粒徑大小、形態及分布、納米粒之間是否聚集。

2.2.2 粒徑分布及Zeta電位的測定 采用動態散射納米粒度儀測定CG-CaP/NPs的粒徑及其分布、Zeta電位，重復測量3次。

2.2.3 DSC的測定 取ICG原料藥、空白磷酸鈣納米粒、ICG原料藥與空白磷酸鈣納米粒物理混合物和ICG-CaP/NPs適量，進行 DSC 分析。掃描溫度0～280℃，掃描速度10℃·min－1，氮氣流量50 mL·min－1，觀察ICG-CaP/NPs中ICG的存在形態。

2.2.4 載藥量與包封率的測定 精密稱取ICGCaP/NPs 5 mg于5 mL量瓶中，加0.4%磷酸適量超聲溶解，甲醇定容。采用紫外分光光度計在782 nm處測定樣品吸光度，計算藥物的載藥量及包封率，計算公式如下：載藥量（%）＝納米粒中包封的ICG質量/包封ICG的納米載體的總重量×100%；包封率（%）＝納米粒中包封藥物質量/投入的總藥量×100%。

2.2.5 體外釋放度 采用透析法進行藥物釋放行為的研究，具體試驗操作過程如下：分別精密稱量制備的磷酸鈣納米粒凍干粉80 mg，兩份，精密吸取1.0076 mg·mL－1的ICG對照品溶液0.5 mL，兩份，樣品和對照品分別加入pH 7.4和5.5的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）25 mL溶解攪拌均勻。將4份溶液分別置于分子截留量3500 Da纖維素透析袋中，400 r·min－1磁力攪拌下透析，透析液500 mL，于0，1，2，4，8，12 h取透析袋中溶液測吸光度，取樣后補等量相應空白緩沖液，計算釋放量，并繪制曲線。

3 結果

3.1 Box-Behnken響應面法優選ICG-CaP/NPs最佳制備工藝

3.1.1 模型擬合 將表1試驗數據運用Design Expert.V8.0.6.1 進行模型擬合，并通過相關系數r2等對擬合自模型進行評價，得出因變量粒徑（Y1）與3個自變量Ca/P比值（A）、pH（B）、ICG加入量（C）的二次多項回歸方程如下：Y1＝73.50－31.29A＋30.86B＋3.93C－6.60AB＋20.58AC＋22.93BC＋29.38A2＋21.67B2＋2.20C2，r2＝0.9799，方差分析結果F＝37.96，P＜0.01（見表2）；因變量載藥量（Y2）與3個自變量Ca/P比值（A）、pH（B）、ICG加入量（C）的二次多項回歸方程如下：Y2＝1.31－0.029A＋0.065B＋0.00625C＋0.062AB＋0.01AC＋0.0025BC－0.28A2－0.20B2－0.22C2，r2＝0.9842，方差分析結果F＝48.39，P＜0.01（見表3）；因變量包封率（Y3）與3個自變量Ca/P比值（A）、pH（B）、ICG加入量（C）的二次多項回歸方程如下：Y3＝66.57－6.41A＋2.18B＋1.40C＋7.17AB－1.38AC＋1.17BC－8.46A2－5.85B2－4.80C2，r2＝0.9407，方差分析結果，F＝12.33，P＜0.01（見表4）。因變量粒徑（Y1）、載藥量（Y2）和包封率（Y3）分別與3個自變量Ca/P比值（A）、pH（B）、ICG加入量（C）的方差分析結果表明，模型具有顯著差異性；失擬項不顯著，說明該模型擬合度和可信度均有效，試驗誤差小，可以用此模型對ICG-CaP/NPs的制備工藝進行分析和預測。

表1 Box-Behnben 中心組合方法試驗設計及結果Tab 1 Design and results of Box-Behnben test

表2 粒徑二次多項回歸方程的ANOVA分析Tab 2 ANOVA of regression equation of particle size

表3 載藥量二次多項回歸方程的ANOVA分析Tab 3 ANOVA of regression equation of drug loading

表4 包封率二次多項回歸方程的ANOVA分析Tab 4 ANOVA of regression equation of encapsulation efficiency

3.1.2 模型優化分析 根據擬合方程，通過Design Expert.V 8.0.6.1 軟件繪制ICG-CaP/NPs制備工藝評價指標隨因素變化的等高線圖和響應面圖（見圖1）。由等高線圖可以看出，鈣磷比和pH對載藥量和包封率的影響成拋物線，即在一定范圍內，隨ICG用量和pH的增加，載藥量和包封率均呈現先增大后減小的趨勢，當鈣磷比一定時，粒徑隨pH的增大而增大，兩者成正相關。

圖1 自變量A～C的等高線圖和相應曲面圖Fig 1 Contour plot and response surface diagram of A～C

3.1.3 驗證試驗 根據“3.1.1”和“3.1.2”中的模型擬合結果和模型優化分析，選取響應值粒徑（50～100 nm），載藥量和包封率最大為優選條件，得到 ICG-CaP/NPs 制備工藝的預測值見圖2，預測最佳工藝得到的粒徑為80 nm，包封率和載藥量分別為67.37%、1.31%。綜合考慮粒徑、載藥量和包封率，確定 ICG-CaP/NPs 的最佳制備工藝為 Ca/P 比值1.67、pH 8.5、ICG加入量1 mg。按照優化的處方平行重復 3 次，得ICG-CaP/NPs平均粒徑（73.5±4.5）nm，包封率和載藥量分別為（64.94±1.31）%、（1.32±0.02）%。與預測值較為吻合，表明所建立的模型預測性良好，該工藝條件穩定可行。

圖2 ICG-CaP/NPs制備工藝預測值Fig 2 Predictive value of preparation processing of ICG-CaP/NPs

3.2 最優處方制劑質量評價

3.2.1 微觀形態 圖3可知，ICG-CaP/NPs 在形態上呈球形或類球形，形態規則，大小較均勻，納米粒之間無聚集，粒徑大小在50～100 nm。

圖3 ICG-CaP/NPs透射電鏡圖（2000×）Fig 3 Transmission electron microscopy of ICG-CaP/NPs（2000×）

3.2.2 粒徑分布及Zeta電位的測定 結果顯示ICG-CaP/NPs粒徑為（73.5±4.5）nm，PDI值為0.204，粒徑分布均勻，Zeta電位為（－41.0±1.8）mV，結果見圖4。

圖4 ICG-CaP/NPs粒徑（A）和Zeta電位（B）圖Fig 4 Particle distribution（A）and Zeta potential（B）distribution of ICG-CaP/NPs

3.2.3 DSC測定 由圖5可知，ICG原料在 243℃處有1個很明顯的放熱峰，對應于ICG 的熔點；而且ICG與空白CaP/NPs物理混合在 243℃處也有1個很明顯的放熱峰；而ICG-CaP/NPs 在243℃處沒有ICG的峰，而且也無新的峰出現。由此說明，ICG 在納米粒中以無定型狀態存在。

圖5 ICG-CaP/Nps（A）、空白CaP/Nps（B）、空白CaP/NPs與ICG物理混合物（C）及ICG原料（D）的DSC圖Fig 5 DSC of ICG-CaP/Nps（A），blank CaP/Nps（B），physical mixture of blank CaP/Nps and ICG（C），and ICG（D）

3.2.4 載藥量和包封率的測定 ICG-CaP/NPs的平均包封率和載藥量分別為（64.94±1.31）%、（1.32± 0.02）%，ICG-CaP/NPs 具有較高的包封率，但載藥量較低，推測其可能原因是其載藥能力主要依靠磷酸鈣的物理吸附和鈣離子與 ICG 中磺酸基的結合，吸附作用和離子鍵結合較弱，長時間透析容易解離。

3.2.5 體外釋放度 由圖6可知，ICG-CaP/NPs 在pH 5.5 條件下的釋放速率與對照品溶液釋放趨勢基本一致，12 h累積釋放量達 59.21%，遠高于 pH 7.4時的釋放速率。由此可知，磷酸鈣納米粒中藥物的釋放具有 pH 敏感性。在 pH 5.5 時釋放完全，在 pH 7.4 條件下具有緩釋作用。pH 5.5 條件下，ICG-CaP/NPs的釋放度高于 ICG 對照品溶液，可能與納米粒對 ICG 穩定性的保護作用有關。

圖6 ICG-CAP/NPs和ICG對照品的體外釋藥曲線Fig 6 In vitro release curve of ICG-CAP/NPs and ICG

4 討論

本試驗選用Box-BehnKen 試驗設計建立 3 因素 3 水平的試驗模型，考察 ICG-CaP/NPs 制備工藝并對處方進行優化分析。確定最佳工藝為 Ca/P 比值 1.67、pH 8.5、ICG加入量1 mg。預測工藝得到的粒徑為80 nm，包封率和載藥量分別為67.37%、1.31%。最優工藝制備下得到的ICG-CaP/NPs平均粒徑（73.5±4.5）nm；Zeta電位（－41.0±1.8）mV；包封率和載藥量分別為（64.94±1.31）%、（1.32±0.02）%。與預測值較為吻合。

測定納米粒的包封率和載藥量的方法主要有超濾離心法、高速離心法、透析法、葡聚糖凝膠柱法等，本試驗選用透析法測定包封率和載藥量。該試驗載藥性能取決于 ICG 中磺酸基與鈣離子的離子鍵結合能力以及磷酸鈣的物理吸附。本試驗測得的載藥量偏低，推測是由于磷酸鈣納米粒與 ICG 間的吸附作用和離子鍵結合較弱，長時間透析過程中容易解離，從而導致 ICG-CaP/NPs 載藥量偏低。

測定釋放度時，由于ICG在水溶液中不穩定，透析過程中會有所降解。因此本試驗同時測定了ICG對照品溶液和ICG-CaP/NPs溶液在 pH 5.5和 7.4 條件下的釋放度，對比對照品溶液和納米粒溶液中 ICG 釋放情況，使體外釋放測定更加準確。