基于轉錄組學的芍藥內酯苷抗肝癌的作用機制研究

周雅婷，羅志強，張彬彬，王武斌，孫睿，于國華*，史淵源，2*（.北京中醫藥大學生命科學學院，北京 02488；2.深圳北京中醫藥大學研究院，深圳 588）

肝癌是全球癌癥診出率排第六的癌癥，西醫療法是治療肝癌的主要策略（如手術切除、肝移植、射頻、化療和靶向分子治療），但肝癌患者的一般預后仍然不佳[1]。中醫學認為，癌癥由痰濁、氣滯、血瘀等病理產物與乖戾之氣相合，郁積化為癌毒，邪盛正虛所致。臨床治法強調肝脾同調，療效肯定[2]。白芍在中醫理論中歸肝經，具有平肝止痛、養血調經、斂陰止汗等功效，其靶器官很可能在肝臟。實驗研究表明白芍有抑制腫瘤生長[3]、逆轉腫瘤耐藥[4]、影響肝癌預后[5]、抑制細胞遷移和侵襲[6]等作用。但相關研究多集中于中藥復方或者單味中藥，中藥藥物成分復雜，有多靶點多通路作用的特點，對獨立藥物成分抗腫瘤作用的研究可以有助于更好地解釋藥物作用的分子機制、指導臨床應用和新藥研發。本研究選取肝癌治療常用藥白芍[7]的主要化學成分——芍藥內酯苷[8]進行體外實驗及轉錄組學研究，進一步探索其抗肝癌作用的生物學機制，為臨床用藥及新藥研發提供參考。

1 材料

1.1 試藥及細胞

芍藥內酯苷（賽譜銳思科技有限公司，貨號：B21149-20 mg）；CCK8試劑盒（北京蘭博利德商貿有限公司，貨號：ceb044hu）；Gibco澳洲胎牛血清（FBS，英濰捷基貿易有限公司，貨號：10099141C）；Corning-Cellgro RMPI 1640培養基（貨號：10-040-CVR）、Corning-Cellgro 0.25%EDTA胰蛋白酶（貨號：25-053-CI）（北京拜爾迪生物技術有限公司）；Gibco青鏈霉素雙抗（P/S，北京歐北生物科技有限公司，貨號：15140122）；PBS干粉（北京百諾威生物科技有限公司，貨號：p1010）；Qiagen RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit（上海優寧維生物科技股份有限公司，貨號：74104）；Illumina TruSeqTM RNA sample preparation Kit（貨號：RS-122-2001）、Invitrogen SuperScript double-stranded cDNA synthesis Kit（貨號：11917020）（上海美吉生物醫藥科技有限公司）。HepG2細胞系（北京協和醫學院）。

1.2 儀器

光學普通倒置顯微鏡（日本Olympus CKX53）；光學正倒置一體顯微鏡（日本ECHO RVL-100）；CO2恒溫培養箱160i（美國Thermo Scientific）；酶標儀（美國Molecular Devices SpectraMax i3X）；紫外分光光度計（美國Thermo NanoDrop One）；高通量測序平臺（美國Illumina Novaseq 6000）；電泳儀（中國六一DYCP-32B）；生物芯片分析儀（美國Agilent 2100）。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 不同濃度芍藥內酯苷溶液 取芍藥內酯苷樣品 5 mg，用RPMI 1640細胞培養基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗）溶解，渦旋5 min，逐步稀釋成濃度為50、100、250、500、1000、1500、2000、5000 μmol·L－1的溶液。

2.1.2 0.1%結晶紫溶液 稱取適量結晶紫，用無水乙醇溶解配制成濃度為0.5%的結晶紫母液。以1∶4比例用PBS將其稀釋成0.1%的結晶紫溶液，用以細胞侵襲實驗染色。

2.2 細胞培養

HepG2細胞培養于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基中，37℃、5%CO2條件下培養。每1～2日傳代一次，取對數生長期的細胞進行實驗。

2.3 CCK8法檢測細胞活性

取對數生長期HepG2細胞進行消化計數，將細胞濃度調整為約4×104個·mL－1，以每孔180 μL分別接種于96孔板中，培養24 h后，分別加入20 μL各濃度芍藥內酯苷溶液[終濃度為5、10、25、50、100、150、200 μmol·L－1]，繼續培養48 h后，每孔加入10 μL CCK8，孵育1 h后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度，計算細胞存活率。以不加藥的細胞為對照。細胞存活率（%）＝OD樣品/OD對照×100%。

2.4 細胞侵襲實驗

用無血清的預冷細胞培養基稀釋matrigel基質膠，至濃度為250 μg·mL－1。將150 μL稀釋膠加入到transwell上室中。37℃條件下孵育2～4 h后去除未結合的matrigel基質膠。饑餓細胞12～24 h后消化離心收集細胞沉淀，PBS清洗1～2遍，用適量芍藥內酯苷溶液（終濃度為200 μmol·L－1）或培養基（對照）重懸，調整細胞濃度至2×105個·mL－1。取細胞懸液200 μL加入transwell小室，下室加入含血清的培養基500 μL。放入培養箱37℃、5%CO2條件下培養24 h后染色拍照計數。

2.5 總RNA提取

將細胞分成對照組（C組）和500 μmol·L－1芍藥內酯苷給藥組（ALB組）兩個組，每組3個復孔。將細胞懸液鋪進12孔板中，7200個/孔，培養24 h后，去除上層培養基，對照組加入培養基200 μL，給藥組加入含終濃度為500 μmol·L－1的芍藥內酯苷培養基溶液200 μL，37℃、5%CO2條件下培養24 h。加200 μL 0.25% EDTA胰蛋白酶將12孔板中的細胞消化1 min后終止消化，1000 r·min－1離心，棄去上清液，用PBS清洗細胞。按RNeasy Mini Kit說明書提取總RNA，測定RNA濃度和OD260/OD280比值后備用。

2.6 轉錄組測序

真核mRNA測序使用基于第二代測序技術的Illumina Novaseq 6000測序平臺，對真核生物特定組織或細胞在某個時期轉錄出來的所有mRNA進行測序，測序實驗采用Illumina TruSeqTM RNA sample prep Kit試劑盒進行文庫構建。

2.7 測序數據處理

運用SeqPrep（https：//github.com/jstjohn/SeqPrep）和Sickle（https：//github.com/najoshi/sickle）軟件對原始測序數據進行過濾分析。將質控后的數據，即clean data（reads）與參考基因組進行比對，使用HISAT2（https：//daehwankimlab.github.io/hisat2/）[9]軟件進行序列比對分析。獲得用于后續分析的mapped data（reads），同時運用測序覆蓋度的指標對本次測序的比對結果進行質量評估。使用軟件StringTie（http：//ccb.jhu.edu/software/stringtie/）[10]將mapped reads進行組裝拼接，與已知轉錄本進行比較，獲得沒有注釋信息的轉錄本，并對其中潛在的新轉錄本進行功能注釋。總結它們注釋到GO、KEGG、EggCOG、NR、Swiss-Prot、Pfam常用的六大數據庫中的數量和百分比。使用RSEM[11]軟件分別對基因/轉錄本的表達水平進行定量分析，獲得每個樣本基因/轉錄本的Read Counts。然后對其進行FPKM或TPM轉換，進而得到標準化的基因/轉錄本表達水平。獲得基因/轉錄本的Read Counts數后，運用DESeq2[12]多樣本（≥ 2）項目進行樣本間基因/轉錄本的表達差異分析，設定閾值差異倍數Fold-change ≥ 2，P-value＜0.05篩選差異基因，通過Goatools[13]和R語言編寫腳本分析對差異基因集進行聚類分析，GO功能分析，KEGG通路富集分析、基因表達差異分析。

3 結果

3.1 抗肝癌活性

芍藥內酯苷抗肝癌活性結果見圖1。48 h后，HepG2細胞隨著芍藥內酯苷濃度升高，存活率顯著下降，在200 μmol·L－1時，存活率只有54%，接近其IC50值。說明芍藥內酯苷具有抑制肝癌細胞生長的效果。

圖1 芍藥內酯苷對HepG2細胞的生長抑制作用（n＝3）Fig 1 Growth inhibitory effect of albiflorin on HepG2 cells（n＝3）

3.2 細胞侵襲實驗

如圖2所示，當芍藥內酯苷濃度為200 μmol·L－1時，具有顯著的抑制肝癌細胞侵襲的效果（P＜0.05）。說明抑制侵襲可能是芍藥內酯苷發揮抗腫瘤作用的途徑之一。

圖2 芍藥內酯苷對HepG2細胞侵襲抑制作用（n＝3）Fig 2 Inhibition of albiflorin on the invasion of HepG2 cells（n＝3）

3.3 測序數據質控

對原始測序數據測序接頭序列、低質量讀段等因素過濾后的質控分析如表1所示。由表1可知，對原始數據低質量的因素進行過濾后，所測樣本的Q30仍全部大于90%，說明樣本的測序質量很高，可以用于序列比對分析。

表1 測序數據質控結果分析表Tab 1 Analysis table of sequencing data quality control results

3.4 轉錄組表達分析

一般認為基因表達量（log10[TPM]）在1以上具有較好的表達效果。因此，我們設置表達量為1，經篩選得到，ALB組表達14 167個基因，C組表達14 184個基因，經韋恩圖分析發現，交叉基因13 815個，單獨在ALB組表達的基因數是352個，單獨在C組表達的基因數是369個。

3.5 轉錄組差異分析

經篩選，ALB組與空白C組相比，共得到340個差異表達基因，其中上調基因154個，下調基因186個，見圖3（橫坐標為基因在兩個樣本間表達差異的倍數變化值的對數，縱坐標為基因表達量變化差異的統計學檢驗值，即P值的對數。圖中每個點代表一個特定的基因，紅色點表示顯著上調的基因，綠色點表示顯著下調的基因，灰色點為非顯著差異基因）。通過對340個差異基因進行GO功能富集和KEGG功能富集，對差異基因的功能進行分類和關聯。篩選得到GO條目的前10個條目，包括富集到BP模塊的差異基因，主要涉及到半乳糖基神經酰胺生物合成、IL13的細胞應答和鈣離子跨膜轉運等過程；富集到CC模塊的差異基因，主要涉及到核內膜和核膜部分的組成；富集到MF模塊的差異基因，主要涉及到膽堿跨膜轉運蛋白活性。結果見表2。

圖3 差異基因火山圖Fig 3 Differences gene volcanic map

表2 GO功能富集結果Tab 2 Results of GO functional enrichment

KEGG功能富集分析篩選得到8條生物學通路，見圖4，包括色氨酸代謝通路、磷酸肌醇代謝通路、神經活性配體-受體相互作用通路、癌癥膽堿代謝通路、腎素-血管緊張素系統通路、鈣信號通路、炎癥介質對色氨酸通道的調節通路、縫隙連接通路，主要集中在信號轉導、代謝活動、神經活性等方面。

圖4 KEGG功能富集的關鍵生物學通路Fig 4 Key biological pathways of KEGG functional enrichment

肝癌的發展過程一般呈現出四個階段，從炎癥反應到脂肪變性到肝硬化再到肝細胞癌，在這個過程當中，代謝功能出現了紊亂，尤其是脂質代謝和蛋白質代謝的異常變化[14-15]。脂質是細胞膜的主要組成部分，在腫瘤細胞的血管形成、細胞增殖、侵襲及轉移中具有不容忽視的作用。蛋白質代謝產生氨基酸，肝癌細胞對氨基酸的代謝是其能量的主要來源，對細胞的生長增殖具有重要意義。因此，癌癥膽堿代謝通路、磷酸肌醇代謝通路與色氨酸代謝通路在肝癌細胞的發展過程中發揮重要作用。

腎素-血管緊張素系統常常在肝病患者體內活化增高，血管緊張素Ⅱ可以誘導血管內皮生長因子形成，促進血管生成，推動腫瘤的基本發展過程，引起肝癌的發生和加劇[16]。

瞬時受體電位（transient receptor poential，TRP）通道，是廣泛存在的一種陽離子通道，可以與多種炎癥因子結合，激活TRP通道通透鈣離子（Ca2＋）等陽離子，活化鈣信號通路等陽離子信號通路，通過對陽離子濃度變化的調節進一步影響細胞內相應信號通路的傳遞、轉導和整合，引起細胞功能特性的改變[17]。Ca2＋作為一種重要的信號轉導媒介，可以通過TRP通道的傳導，激活下游的生物學過程，促進肝癌細胞的增殖。

近年來，神經系統和神經遞質在腫瘤微環境中的作用逐漸受到關注，研究表明其通過激活相應的信號通路來刺激細胞生長或增加細胞的遷移活動[18]，提示了神經活性配體-受體相互作用通路在肝癌發展過程中的重要性。

研究發現，細胞縫隙連接與腫瘤的生長、增殖和變化關系密切[19]。在癌變初始階段，癌細胞與周圍正常細胞的細胞間隙連接功能被抑制，通信障礙導致細胞喪失接觸抑制而無限擴增，由此形成癌變[20]。趙增強等[21]通過實驗研究發現，冬凌草甲素能增強 HepG2細胞間縫隙連接功能，重建HepG2細胞間通信，闡釋了該藥物治療肝癌的可能的作用機制之一，說明細胞縫隙連接在肝癌發生發展進程中發揮了重要作用。

芍藥內酯苷對8條關鍵通路的調控集中于10個上調基因（GRM1、ADRB1、P2RX7、BDKRB1、REN、ASIC4、SLC22A2、AC002996.1、AC104662.2、AC092143.2），12個下調基因（TUBA8、PHKA2-AS1、CACNA1H、PLCG1-AS1、RHEBP1、SLC44A5、AANAT、AC135048.1、AL513325.1、AC027796.3、AC011603.2、AL355315.1），其中調控兩條以上關鍵通路的基因為BDKRB1（2條）、AC011603.2（2條）、TUBA8（2條）、ADRB1（3條）、GRM1（3條）、PLCG1-AS1（4條）。

4 討論

中藥對腫瘤的殺傷能力普遍弱于化學藥物，但中藥在提高患者免疫力，減輕放化療的毒副作用、減輕疼痛、防止癌細胞轉移等方面具有獨特的優勢。因此，采用中藥配合放化療等主流療法來抗擊腫瘤，對于提高患者的生存質量具有重要的意義[22]。本研究選取芍藥代表性成分芍藥內酯苷來探討其抑制肝癌的作用效果，芍藥內酯苷能有效抑制腫瘤生長和侵襲，在25 μmol·L－1時對HepG2的抑制率即達到30%，且已有動物實驗表明芍藥內酯苷具有明確鎮痛作用[23-24]，可聯合化學藥物作為輔助用藥，降低化學藥物用藥劑量，減輕患者痛苦。

本研究結合轉錄組測序技術探究了芍藥內酯苷抗肝癌細胞的調控機制，獲得了芍藥內酯苷調控的關鍵差異基因，并通過大數據通路富集等方法，進一步挖掘了其分子作用機制。GO功能中富集的差異基因，主要涉及到半乳糖基神經酰胺生物合成、IL13的細胞應答和鈣離子跨膜轉運、核內膜和核膜部分的組成、膽堿跨膜轉運蛋白活性。在KEGG功能分析中，主要集中在信號轉導、代謝活動、神經活性等方面。許多重要的細胞生命活動如細胞增殖、分化以及死亡均與信號傳導密不可分。代謝為細胞增殖遷移活動提供能量保障。KEGG富集通路中受調節的重要編碼區上調基因為BDKRB1、ADRB1、GRM1，下調基因為TUBA8。BDKRB1為緩激肽受體，BDKRB1上調可通過下游響應促進PAK表達[25]，抑制MLCK降低肌球蛋白收縮，減少肝癌細胞遷移[26]；BDKRB1還可以通過調節鈣離子信號通路上調PKC同工酶表達，抑制腫瘤細胞侵襲[27]。TUBA8編碼α微管蛋白家族的成員，實驗表明TUBA8過表達增強HepG2細胞中的細胞遷移[28]。ADRB1、GRM1通過調節cAMP、Ca2＋濃度影響PKA、PKC，調控細胞縫隙連接，抑制肝癌細胞遷移和增殖[29-30]。因此，芍藥內酯苷很可能是通過對上述相關通路及基因進行調控實現抑制HepG2細胞系的生長增殖與遷移。

綜上所述，芍藥內酯苷對于減少化學藥物的給藥劑量以減輕其毒副作用，減輕患者癌性疼痛和減少癌細胞侵襲等具有“增效減毒”的可能。這一方面可為白芍的臨床應用及生物學效應機制提供部分理論支持；另一方面可為新藥研發提供指導。