高效液相色譜法測定格列齊特平衡溶解度及表觀油水分配系數

唐秀秀，褚信信，王莉麗，謝子立*（.安徽中醫藥大學，合肥 30038；.安徽省食品藥品檢驗研究院，合肥3005）

格列齊特是第二代磺脲類口服降糖藥，用于治療2型糖尿病，它通過刺激胰島細胞釋放胰島素發揮作用，耐受性好，很少引起低血糖，此外，它還有減緩糖尿病性視網膜病變的潛力，是長期治療非胰島素依賴型糖尿病的首選藥[1-3]，被列入WHO基本藥物清單中[4]。藥物的理化參數與其在生物體內膜通透性有很大相關性，平衡溶解度及油水分配系數作為藥物理化參數兩個不可或缺的指標，對于預測藥物在體內的吸收、分布、代謝、排泄有很大幫助[5]。格列齊特原料及制劑的現行質量標準分別收載在《中國藥典》2015年版二部以及局頒標準，其含量測定分別采用電位滴定法和HPLC法[6]，現行標準涉及的HPLC法中流動相基本采用三氟乙酸，流動相的pH值較低約為2，長期使用易造成色譜柱的損壞。本文通過參考相關文獻[7-8]，建立了色譜條件溫和的HPLC法用于格列齊特的含量測定，通過方法學考察均符合要求，結果顯示本次建立的HPLC法適用于格列齊特的含量測定。在此基礎上，采用搖瓶法[9-11]測定格列齊特在水及不同pH的磷酸鹽緩沖溶液與pH 1.2的鹽酸溶液中的平衡溶解度和正辛醇-水/不同pH的磷酸鹽緩沖溶液中表觀油水分配系數，為格列齊特制劑研究、處方設計、仿制藥一致性評價提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AD系列高效液相色譜儀（日本島津公司）；AG-135電子天平、SevenExcellence S400 pH計（Mettler Toledo公司）；HC-3018R 離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；SHY-2A 水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）。

格列齊特對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100269-201906，純度：99.9%）；格列齊特原料（批號：P011-2001015，山東科源制藥有限公司，純度大于99%）。乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；無水甲酸（色譜純，天津市光復精細化工研究所）；醋酸銨、正辛醇、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性

采用Unitary C8色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.02 mol·L－1醋酸銨溶液（甲酸調pH至3.5）（45∶55）為流動相，柱溫35℃，檢測波長235 nm，流速1.0 mL·min－1，進樣量20 μL。在此色譜條件下進行分析，并記錄色譜圖。色譜圖見圖1，格列齊特保留時間為14 min，峰形良好，空白溶劑對測定無干擾。

圖1 格列齊特高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of gliclazide

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取格列齊特對照品15.65 mg，置50 mL量瓶，加乙腈22.5 mL超聲溶解，用水稀釋至刻度，作為對照品儲備液。精密量取上述儲備液5 mL置25 mL量瓶中，用乙腈-水（45∶55）稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2 不同pH溶液的制備 按《中國藥典》2015年版四部緩沖液的配制方法[12]，分別配制pH為4.5，6.8，7.4的磷酸鹽緩沖溶液。另稱取氫氧化鈉2 g，加磷酸二氫鉀6.8 g置于1000 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，配成pH為8.6的磷酸鹽緩沖溶液；稱取氯化鈉2.0 g，置于1000 mL量瓶中，加入濃鹽酸7 mL，加水溶解并稀釋至刻度，配成pH為1.2的鹽酸溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下的對照品儲備液2、3、4、5 mL分別置25 mL量瓶中，分別用乙腈-水（45∶55）稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液①②③④。精密量取“2.2.1”項下的對照品儲備液4、6 mL分別置10 mL量瓶中，分別用乙腈-水（45∶55）稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液⑤⑥。精密量取上述①～⑥溶液各20 μL，注入液相色譜儀中，按“2.1”項下色譜條件測定，以對照品的質量濃度（C）為橫坐標，以格列齊特峰面積（A）為縱坐標，進行線性回歸，得格列齊特的回歸方程為A＝4.06×107C－1.29×105（r＝0.9996），結果表明格列齊特在0.025 01～0.187 61 mg·mL－1與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.2 檢測限與定量限 精密量取“2.2.1”項下的對照品儲備液，用乙腈-水（45∶55）逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以S/N＝3確定檢測限，以S/N＝10確定定量限。結果顯示格列齊特的檢測限和定量限分別為0.18 μg·mL－1和0.61 μg·mL－1。

2.3.3 精密度試驗 精密量取格列齊特對照品溶液 20 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定 6次，記錄色譜峰面積，計算峰面積RSD為0.18%（n＝6），結果表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 平行稱取格列齊特原料藥6份，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，格列齊特含量RSD為0.96%，結果表明本法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 平行稱取格列齊特原料藥6份，精密稱定，分別加入水、“2.2.2”項下pH值分別為4.5、6.8、7.4、8.6的磷酸鹽緩沖溶液、pH 1.2的鹽酸溶液和乙腈-水（45∶55）溶液，配制質量濃度為0.06 mg·mL－1的供試品溶液。分別精密吸取上述溶液及“2.2.1”項下的對照品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件，于0、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h進樣測定，記錄峰面積，以峰面積計算得到RSD分別為1.7%、1.3%、0.55%、0.95%、0.38%、15.4%及0.35%。結果表明格列齊特在水、4種磷酸鹽緩沖溶液介質及乙腈-水（45∶55）溶液中72 h內較穩定；在pH為1.2的鹽酸溶液中72 h不穩定，在4 h內穩定，RSD小于2.0%。

2.3.6 加樣回收試驗 取已知含量的格列齊特原料藥7.5 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，共9份，平均分為3組，分別加入格列齊特對照品6.0、7.5、9.0 mg，精密稱定，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，格列齊特低、中、高水平回收率分別為99.9%、98.5%、98.2%，RSD分別為0.84%、1.0%、0.17%，結果表明該方法準確度良好。

2.4 格列齊特平衡溶解度的測定

2.4.1 轉速與振搖時間考察 將恒溫水浴的轉速分別設置為50、100和200 r·min－1，選擇pH為4.5和8.6兩種磷酸鹽緩沖溶液在（37±0.5）℃條件下振搖72 h，0.45 μm濾膜濾過，吸取續濾液（或稀釋后），按“2.1”項下色譜條件測定，結果見表1。由表1可知，在pH為4.5的磷酸鹽緩沖溶液中，轉速的改變對格列齊特的溶解度沒有明顯的影響；在pH為8.6的磷酸鹽緩沖溶液中，恒溫水浴轉速為50和100 r·min－1時，格列齊特溶解度24 h才達平衡，恒溫水浴轉速為200 r·min－1時，格列齊特溶解度在2 h達到平衡。因此，為了使樣品能夠充分溶解確保測得的平衡溶解度準確、有效，本研究最終確定格列齊特的平衡溶解度測定轉速及振搖時間分別為200 r·min－1、24 h。

表1 平衡溶解度轉速和振搖時間的考察(n＝3，mg·mL－1)Tab 1 Equilibrium solubility speed and shaking time(n＝3，mg·mL－1)

2.4.2 平衡溶解度的測定 量取水及“2.2.2”項下配制的不同pH緩沖溶液各50 mL，分別置于100 mL碘量瓶中，加入過量的格列齊特原料藥粉末至溶液中出現大量不溶性沉淀，在（37±0.5）℃，200 r·min－1條件下振搖 24 h，0.45 μm濾膜濾過。吸取續濾液（或稀釋后），按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算格列齊特在水及不同介質中的平衡溶解度，結果見表2。

表2 格列齊特的平衡溶解度計算結果(n＝3)Tab 2 Equilibrium solubility of gliclazide (n＝3)

2.5 格列齊特表觀油水分配系數的測定

吸取正辛醇溶液適量，分別與同體積水及pH為4.5、6.8、7.4、8.6的磷酸鹽緩沖溶液混合，在（37±0.5）℃，200 r·min－1條件下振搖24 h，分取上層和下層，即得水及不同pH磷酸鹽緩沖溶液飽和的正辛醇、正辛醇飽和的水及不同pH的磷酸鹽緩沖溶液。

分別吸取水及不同pH磷酸鹽緩沖溶液飽和的正辛醇20 mL，置50 mL的離心管中，加入過量的格列齊特原料藥粉末至溶液中出現大量不溶性白色沉淀，置恒溫水浴振蕩器中，在（37±0.5）℃，200 r·min－1條件下振搖 24 h，經0.45 μm 濾膜濾過，取續濾液作為相應的儲備溶液；分別精密量取上述溶液適量，用甲醇準確稀釋50 倍，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算格列齊特初始濃度C0。

分別精密量取上述儲備溶液各10 mL，置50 mL的離心管中，分別加入10 mL正辛醇飽和的水及pH為4.5、6.8、7.4、8.6的磷酸鹽緩沖溶液，將離心管置于水浴恒溫振蕩器中，在（37±0.5）℃，200 r·min－1條件下振搖 24 h，離心（12 000 r·min－1，10 min），用注射器吸取水層，經0.45 μm 濾膜濾過，吸取續濾液（或稀釋后），按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，以外標法計算格列齊特質量濃度CW。根據公式P＝（C0－CW）/CW計算表觀油水分配系數，結果見表3。

表3 格列齊特表觀油水分配系數計算結果(n＝3)Tab 3 Apparent oil-water partition coefficient of gliclazide (n＝3)

3 討論

3.1 流動相的選擇

《中國藥典》2015年版二部收載的格列齊特、格列齊特片（Ⅱ）含量測定方法分別為電位滴定法和HPLC法，后者流動相中的三氟乙酸對色譜柱損傷較大，耐用性較差且不適用于后期質譜方法研究。本研究考察了0.01、0.02、0.05 mol·L－1醋酸銨溶液對格列齊特峰形的影響，醋酸銨溶液濃度在0.01 mol·L－1時，格列齊特峰對稱性及拖尾因子均達不到要求，0.02、0.05 mol·L－1醋酸銨溶液雖都能達到要求，但0.05 mol·L－1醋酸銨溶液調至pH 3.5所需酸量較多，因此最終將醋酸銨溶液濃度定為0.02 mol·L－1。考察流動相的配比對出峰時間、分離度的影響，乙腈量減少，保留時間延長，45%的乙腈配比時分離度能達到要求且格列齊特峰保留時間較為合適。另考察冰醋酸和甲酸調節醋酸銨溶液以及不同pH值對出峰的影響，由于在調節pH時冰醋酸用量較大，采用甲酸調節較為合適且在pH 3.5時格列齊特峰的分離度、理論塔板數、對稱性均能達到要求。比較了《中國藥典》與本研究建立的HPLC法的靈敏度，發現本次研究所建立的色譜方法靈敏度約為《中國藥典》色譜方法的5.5倍，所建立的色譜方法既能滿足測定要求，又有其獨特的優勢，為今后該類色譜條件的選擇、優化提供了思路。

3.2 平衡溶解度

溶解度是影響生物利用度最重要的性質之一，也是確立生物藥劑學分類系統的兩個重要參數之一[13]。藥物的平衡溶解度是指在一定溫度（氣體在一定壓力）下，在一定量溶劑中達飽和時溶解的最大藥量，是反映藥物溶解性的重要指標[14]。本研究采用經典的搖瓶法對格列齊特在水及不同pH的磷酸鹽緩沖溶液中的平衡溶解度進行測定，結果表明格列齊特在水及不同pH緩沖溶液中溶解度按照《中國藥典》表示方法分別為不溶、極微溶解和微溶且平衡溶解度隨著介質pH值的增大而增加。由穩定性試驗可知，格列齊特在pH 1.2鹽酸溶液中不穩定，因此在制劑開發過程應避免酸性輔料或因相互作用產生酸性物質的輔料的加入。

3.3 表觀油水分配系數

體外測定油水分配系數是為了模擬生物體內藥物在水相和生物相之間的分配情況，從而預測其在腸道中的吸收情況[15]。生物膜整體的溶解度參數＆＝（21.07±0.82）（J·cm－3）1/2，與正辛醇的溶解度參數接近，因此通過測定正辛醇與水的分配系數來預測藥物的吸收[16]。lgP對于藥物在胃腸道吸收速度和程度有很大影響，P值過低（lgP＜－2），化合物不能穿過脂質膜；P值過高（lgP＞3），化合物因脂溶性強而難以進入血管或淋巴管。藥物的最佳 lgP值為：－1.0＜lgP＜2.0，在該lgP值范圍內的化合物脂溶性和水溶性適中，具有較好生物膜滲透性，易透過細胞膜吸收和轉運[17]。由本試驗所測得數據可知不同pH介質對格列齊特表觀油水分配系數有一定的影響，格列齊特在水及不同pH值磷酸鹽緩沖溶液的lgP值均在0.06～2.00，多個pH介質測定結果表明格列齊特具有好的滲透性，提示其在胃腸道具有很好的分布與吸收。通過對格列齊特表觀油水分配系數的研究為其制備工藝和處方設計提供理論依據。