亞熱帶不同演替階段森林土壤可溶性有機氮與酶活性特征

常月，丁咸慶，侯紅波，項文化，彭佩欽*

（1. 中南林業(yè)科技大學環(huán)境科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學生命科學與技術(shù)學院，湖南 長沙 410004）

中國亞熱帶地區(qū)以潮濕和溫暖的季風氣候為特征，天然林中樹木種類繁多，并且在演替后期一直由常綠闊葉林所主導[1-2]。但亞熱帶地區(qū)人為干擾強烈，大多數(shù)常綠闊葉林已轉(zhuǎn)變?yōu)槿斯ち只虼紊?林[3]。根據(jù)干擾程度和特定土壤類型和氣候條件下的恢復程度，亞熱帶次生林沿梯度變化可以劃分為針闊混交林、落葉闊葉林和常綠闊葉林等不同恢復演替階段。在植被恢復過程中，土壤酶活性和土壤養(yǎng)分變化已受到眾多研究者的高度關(guān)注。土壤酶活性和土壤氮素是森林植被恢復過程中生態(tài)系統(tǒng)健康水平的重要指標[4-5]。可溶性有機氮（soluble organic nitrogen, SON）是森林N流失主要形式，是土壤N運移的重要指標[6-7]。SON作為森林土壤氮狀況和土壤酶活性的敏感指標，在很大程度上決定著生態(tài)植被恢復的成效。因此，研究不同森林類型土壤SON和酶活性特征及其聯(lián)系對維持森林生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)及森林更新方式的選擇具有重要意義。

有研究表明，SON受多重因素影響，生物因素如植被類型、土壤微生物和土壤酶活性等，非生物因素包括氣候環(huán)境、土壤母質(zhì)、土壤養(yǎng)分、土壤理化性質(zhì)和林分管理措施等，因此SON在不同森林類型下的數(shù)量、質(zhì)量和生物降解性上均應存在顯著不同[8]。植物和土壤微生物可以直接吸收利用土壤中的SON，這一過程中土壤酶參與SON的生成和利用，但兩者之間的聯(lián)系還認識有限[9]。亞熱帶地區(qū)闊葉林土壤SON量明顯高于針葉林[10]，而溫帶地區(qū)不同植被類型土壤SON并沒有顯著差異[11]。土壤SON隨森林演替的變化特征，有待進一步明確。植物根系和微生物在土壤中，會大量分泌胞外酶來輔助養(yǎng)分吸收[12]，通過對土壤酶活性進行定量可反映植物微生物對土壤養(yǎng)分的利用特征[13-14]。同時，土壤酶的活性也會受地表凋落物和土壤養(yǎng)分的顯著影響[15-17]。土壤酶中，葡萄糖苷酶、木糖苷酶主要參與土壤碳循環(huán)過程，乙酰氨基葡糖苷酶參與氮循環(huán)，而磷酸酶主要參與磷循環(huán)。這幾種酶的活性在土壤養(yǎng)分循環(huán)中均發(fā)揮著重要且代表性作用。由于土壤中碳氮磷元素循環(huán)是強烈耦合的過程，土壤SON可能同時受到碳氮磷相關(guān)酶活性的潛在影響。因此，對這幾種降解酶活性的了解，可以為了解不同森林類型土壤SON及養(yǎng)分循環(huán)的差異提供信息，而且能表征土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化能力。

森林演替與土壤氮素轉(zhuǎn)化是生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵過程。森林不同演替階段土壤可溶性有機氮（SON）的數(shù)量和生物降解性上均受到碳氮磷轉(zhuǎn)化相關(guān)酶活性的影響。我國亞熱帶地區(qū)在植被恢復過程中，發(fā)生著明顯的森林演替過程。森林演替過程與土壤肥力動態(tài)變化規(guī)律尤其是礦質(zhì)養(yǎng)分動態(tài)的關(guān)系研究較多[18-19]，但土壤N（尤其是SON）和酶活性如何變化以及兩者之間的關(guān)系尚不清晰。因此，本研究以亞熱帶不同演替階段林地（針葉林、落葉闊葉林和常綠闊葉林）為對象，采集表層土壤樣品，分析亞熱帶常綠闊葉林演替序列森林土壤SON和酶活性特征，探討其特征及其與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，研究SON在養(yǎng)分循環(huán)中扮演的角色，可以為揭示植被 類型與土壤氮庫的動態(tài)耦合關(guān)系，為植被恢復、森林生態(tài)系統(tǒng)管理及其可持續(xù)發(fā)展提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究點位于湖南省長沙市大山?jīng)_森林公園（113°17'～113°19' E，8°23'～28°24' N）。該區(qū)域為典型低山丘陵，屬亞熱帶季風濕潤氣候，海拔高度在55～350 m之間，年均溫度16.7～17.6 ℃，極端高溫40 ℃，極端低溫-11 ℃，雨量充沛，相對濕度較大，年降雨量在1 412～1 559 mm之間。土壤為由板頁巖母質(zhì)發(fā)育而成的紅壤，地帶性代表植被為亞熱帶常綠闊葉林。該園區(qū)現(xiàn)存三種主要自然演替的次生林，分別是馬尾松針葉林（初期）、南酸棗落葉闊葉林 （中期）和石櫟—青岡常綠闊葉林（晚期），這三種次生林代表了森林植被恢復三個階段的主要森林植被類型。選取設置在三種林地的1 hm2長期觀測樣地[6]，地理植被信息見表1。

表1 采樣地信息Table 1 Characteristics of investigated forests

1.2 樣品采集與處理

2016 年11月，在每個樣地按上中下三個坡位沿對角線多點采樣，分別采集3個土壤混合樣品。土壤樣品采集時，先去除地面凋落物，用鐵鍬挖取0～20 cm表層土壤。樣品帶回實驗后，自然風干2周后，剔除可見石礫和根系，木棒碾碎過100目的尼龍篩，用于測定土壤總有機碳（TOC）、全氮（TN）和全磷（TP）等。同時按相同方法每個樣地采集土壤鮮樣各3個，樣品鮮重1～2 kg。土壤鮮樣回實驗室后立即過20目網(wǎng)篩，充分混勻，置于4 ℃保存。新鮮土壤樣品用于測定可溶性有機氮（SON）含量與葡糖胺糖苷酶（NAG）、葡萄糖苷酶（BG）木糖苷酶（BX）和磷酸酶（AP）4種土壤酶活性。

1.3 測定方法

采用2 mol/L KCl溶液浸提鮮土樣，并用凱氏定氮法測土壤可溶性總氮（TSN）、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮，SON含量通過土壤可溶性總氮與土壤無機氮的差值得到[6]。采用重鉻酸鉀—濃硫酸外加熱法，測定土壤總有機碳含量[20]；采用凱氏定氮法消解土壤全氮和全磷，并用間斷化學分析儀（Easychem plus，意大利希思迪）分析測定[21]。土壤微生物生物量碳（MBC）和微生物生物量氮（MBN）采用新鮮土氯仿熏蒸-K2SO4提取法[22-23]。以熏蒸土樣與不熏蒸土樣的提取測定浸提液中的總碳差值乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)KC（2.64）計算得到微生物生物量碳（MBC），以熏蒸土樣與不熏蒸土樣的提取測定浸提液中的總氮差值乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)KN（2.22）計算得到微生物生物量氮（MBN）。采用酸度計（pHS-3C）測定土壤pH，水土比為2.5（超純水）∶1。土壤含水率采用重量法 （鋁盒）測定，105 ℃烘干至恒重，計算烘干前后質(zhì)量差。

土壤酶采用96微孔酶標板熒光分析法。方法如下：取1 g新鮮土壤，用125 ml 50 mmol/L的醋酸鹽緩沖液（pH=5）提取，用磁力攪拌器攪拌5 min使其均質(zhì)化，用移液器取200 μL移于96孔微孔板。用傘形酮作為底物標示水解酶活性。微平板置于暗環(huán)境下經(jīng)過20 ℃恒溫培養(yǎng)后，用多功能酶標儀測定其熒光度。分別測得碳轉(zhuǎn)化酶活性（葡萄糖苷酶BG：4-Methylumbelliferyl-β-D-glucosid；木糖苷酶BX：4-Methylumbelliferyl-β-D-xylopyranoside），底物為4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷、氮轉(zhuǎn)化酶活性（乙酰葡糖胺糖苷酶NAG：4-Methylumbelliferyl-N-Acctyl-β-D-Glucosaminide），底物為4-甲基傘形酮-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，以及磷轉(zhuǎn)化酶活性（磷酸酶AP：4-Methylumbelliferyl phosphate），底物為4-甲基傘形酮-磷酸酶等四種酶動力學活性[24]。

采用米氏方程（The Michaelis-Menten equation）確定酶活性參數(shù)：

式中：V為酶促反應速率（nmol/g/h）；Km為酶半飽和反應濃度（μmol/g）；Vmax為最大酶促反應速率（nmol/g/h）；S為底物濃度（μmol/g）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用軟件SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，并采用Tukey’s test進行顯著性差異分析。對土壤酶活性采用Origin 8.5中米氏方程進行擬合分析。采用CANACO 5.0以土壤酶活性為響應變量，同時以土壤養(yǎng)分以及土壤基本理化性質(zhì)為解釋變量做RDA分析，并繪制排序圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種森林類型土壤SON分析

三種森林類型中，常綠闊葉林土壤SON和無機氮均高于其他兩種次生林（P<0.05）。而且3種林分中針葉林的SON、NH4+-N、NO3--N、MBN、TN均低于常綠闊葉林和落葉闊葉林（P<0.05，表2），說明在相同母質(zhì)下針葉林土壤肥力低于常綠闊葉林和落葉闊葉林，由于常綠闊葉林的地表凋落物較針葉林分解速率更快且分解量大，常綠闊葉林和落葉闊葉林凋落物質(zhì)量較高，含N量高且C/N比低，易分解，歸還土壤的養(yǎng)分較多。針葉林土壤SON占可溶性總氮的比值SON/TSN顯著高于常綠闊葉林和落葉闊葉林（P<0.05），因為闊葉林凋落物高于針葉林，且針葉林凋落物中含有相對較多的難以分解的化合物。土壤SON占全氮的比值SON/TN表現(xiàn)為常綠闊葉林>針葉林>落葉闊葉林。這一指標可以反映土壤SON被分解利用的難易程度，針葉林較闊葉林土壤全氮更難以被利用。

表2 三種森林類型土壤N組分含量及所占比Table 2 Content and proportion of soil N component in three forests

2.2 三種森林類型土壤酶活性分析

四種酶活性隨底物濃度呈現(xiàn)的動力學變化，可以看出，與碳轉(zhuǎn)化有關(guān)的葡萄糖苷酶和木糖苷酶的活性，落葉闊葉林和常綠闊葉林及隨底物上升速率均高于針葉林，且以落葉闊葉林最大；葡糖胺糖苷酶活性，亦有類似表現(xiàn)，但其上升速度緩慢（圖1）。說明落葉闊葉林更有利于葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶的活性的提高。而三種森林類型土壤磷酸酶活性差距較小，上升速度無明顯差異。說明植被演替與碳氮轉(zhuǎn)化相關(guān)酶活性更加密切。

對四種酶進行米氏方程擬合后，動力學參數(shù)見表3。其中，土壤葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶活性最大速率均基本表現(xiàn)為：針葉林<常綠闊葉林<落葉闊葉林，而土壤磷酸酶活性表現(xiàn)為：常綠闊葉林<落葉闊葉林<針葉林，但無顯著差異（表3）。四種酶的半飽和反應濃度中，土壤葡萄糖苷酶、木糖苷酶活和磷酸酶活性表現(xiàn)為：落葉闊葉林<針葉林<常綠闊葉林，而葡糖胺糖苷酶活性表現(xiàn)為：針葉林<落葉闊葉林<常綠闊葉林。四種酶與底物親和力系數(shù)，土壤葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶活性表現(xiàn)為：針葉林<常綠闊葉林<落葉闊葉林，土壤磷酸酶親和力系數(shù)表現(xiàn)為：常綠闊葉林<落葉闊葉林<針葉林。酶活性和酶的親和力表現(xiàn)一致，說明土壤底物（有機質(zhì)）決定了酶反應速率。

表3 三種森林類型土壤酶動力學參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of soil enzymes in three forests

2.3 土壤各指標間相關(guān)性分析

可溶性氮各組分間均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）， 并且與土壤總氮顯著正相關(guān)（P<0.05），與pH顯著負相關(guān)（P<0.05，表4）。土壤葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶之間均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），但與磷酸酶相關(guān)不顯著（P>0.05）。土壤葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶均與土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮和總氮顯著正相關(guān)（P<0.05）， 葡糖胺糖苷酶與總有機碳顯著正相關(guān)（P<0.05）。磷酸酶與總磷呈正相關(guān)關(guān)系，但不顯著。SON與pH呈極顯著負相關(guān)（P<0.01），但與酶活性相關(guān)不顯著（P>0.05）。

表4 三種森林類型土壤各指標之間的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients among soil indicators of three forest types

2.4 土壤酶活性變化的RDA分析

以4種土壤酶活性為響應變量，以土壤理化性質(zhì)和有效養(yǎng)分為解釋變量，對3種林分表層土壤酶活性進行冗余分析，從而探究土壤理化性質(zhì)、有效養(yǎng)分和土壤酶活性之間的相關(guān)關(guān)系。酶活性第一排序軸主要受土壤葡糖胺糖苷酶和葡萄糖苷酶兩種酶控制，第一軸可以解釋酶活性變化的72.06%，酶親和力第一排序軸主要受土壤葡萄糖苷酶和木糖苷酶兩種酶控制，第一軸可以解釋酶親和力變化的83.72%。微生物生物量氮是影響土壤酶活性的主要因素。土壤SON與土壤氮組分、土壤含水率、黏粒、總有機碳、總氮、微生物生物量碳和微生物生物量氮均存在顯著正相關(guān)關(guān)系。SON與土壤葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶呈正相關(guān)，而與土壤容重、pH和砂粒呈顯著負相關(guān)。磷酸酶與總磷呈正相關(guān)，與土壤葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶相關(guān)性不強。土壤葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶親和力之間均呈顯著正相關(guān)，葡糖胺糖苷酶親和力與土壤總氮、微生物生物量碳和微生物生物量氮均顯著正相關(guān)（圖2）。該結(jié)果與土壤理化性質(zhì)和酶活性相關(guān)性分析結(jié)果具有一致性。

3 討論

3.1 森林類型對土壤SON的影響

土壤SON來源眾多[25]，其主要來源于土壤有機質(zhì)、微生物、根系代謝產(chǎn)物和外源氮輸入等[26]。不 同森林植被類型下，樹種通過有機物的輸入和對微生 物和土壤理化性質(zhì)的影響，進而影響土壤SON[6-7]。本研究中，不同演替階段的三種森林類型土壤SON含量基本表現(xiàn)為常綠闊葉林>落葉闊葉林>針葉林，說明土壤SON隨著植被的正向演替而逐漸增加，有利于生態(tài)系統(tǒng)功能的恢復，受植被類型和土壤性質(zhì)等影響明顯。

因植被組成、樹種數(shù)量、生物量、地表凋落物量以及凋落物質(zhì)量不同，這些是造成SON不同的重要影響因素[27]。張琴和范秀華[28]研究發(fā)現(xiàn)，常綠闊葉林的地表凋落物較針葉林，分解速率更快且分解量大。由于闊葉林凋落物質(zhì)量較高，含N量高且C/N比低，容易分解，歸還土壤的養(yǎng)分較多，并且土壤微生物生物量高，而針葉林凋落物養(yǎng)分含量低，其中含有單寧、蠟質(zhì)等物質(zhì)較多難分解，造成土壤微生物生物量低，這些因素都會導致SON的直接來 源量不同，因此闊葉林和針葉林土壤SON差異明顯[29-30]。三種森林類型中，針葉林土壤SON/TSN所占比表現(xiàn)為顯著高于闊葉林(P<0.05)，說明針葉林土壤SON較難分解，并且由于微生物量低，更多的比例SON沒有被利用[31]。由于常綠闊葉林的現(xiàn)存地表凋落物量高于落葉闊葉林[32-33]，土壤微生物生物量碳也以常綠闊葉林最高。盡管落葉闊葉林微生物生物量氮較高，但由于N轉(zhuǎn)化速率也更快，造成SON的消耗，因此常綠闊葉林土壤SON量較落葉闊葉林多。

本研究發(fā)現(xiàn)，SON與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、可溶性總氮和總氮等各養(yǎng)分之間均有顯著或極顯著的相關(guān)，與丁咸慶等[34]和鮑勇等[35]的研究一致。這表明了SON重要N來源和去向，并且SON是可溶性總氮的主要組成部分。You等[36]對本研究區(qū)域這三種類型森林的降水、莖流和地表徑流中的可溶性總氮研究發(fā)現(xiàn)，地表徑流中可溶性總氮濃度隨森林的演替而顯著增加，即從針葉林到落葉闊葉林再到常綠闊葉林。SON是N流失的重要組成部分，未來研究將更多關(guān)注于SON在這其中扮演的重要角色。三種森林土壤SON與pH顯著負相關(guān)（表4），與張丹丹等[37]研究一致，說明土壤酸度會影響SON的量。有研究認為土壤pH可以通過影響與土壤微生物而致SON發(fā)生變化[38]，隨著大氣氮沉降輸入氮的增加，土壤趨于酸化，這可能導致加速SON的流失[39]。

3.2 不同森林土壤酶活性差異及其與SON的聯(lián)系

土壤酶活性是土壤養(yǎng)分周轉(zhuǎn)的重要驅(qū)動因素，對于酶活性隨森林不同演替階段發(fā)生著怎樣的變化還了解不多。已有研究表明，土壤酶作為催化土壤眾多生化反應的主要承載體，受到多種因素的影響，如土壤理化性質(zhì)、微生物種類與數(shù)量、土壤養(yǎng)分狀況、植被組成和土壤地形地貌等[31,40]。其中植被組成不同勢必會導致凋落物、植被根系數(shù)量和質(zhì)量的改變，引起土壤養(yǎng)分的變化，因此森林類型對土壤酶活性有著重要的影響。部分研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞熱帶森林土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮隨植被正向演替呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢[41]。本研究結(jié)果與Feng等[41]的結(jié)果相似：3個演替階段中土壤微生物生物量氮表現(xiàn)為落葉闊葉林>常綠闊葉林>針葉林，這進一步證實了闊葉樹種比例增加會提高土壤微生物活性。

對于土壤酶活性在植被演替過程中的變化特征，有研究發(fā)現(xiàn)，草叢向喬灌階段演替時土壤磷酸酶活性顯著增加，但喬灌向原生林演替時，磷酸酶活性略有下降或平穩(wěn)增加，但差異均不顯著[42]。對溫帶森林土壤葡糖胺糖苷酶活性的研究結(jié)果表明，在人工林向天然更新林演替階段該酶活性顯著增 加[31]。隨植被演替葡萄糖苷酶活性隨著植被演替的變化規(guī)律更為復雜[43]。本研究結(jié)果表明，常綠闊葉林和落葉闊葉林土壤中葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶活性是明顯高于針葉林，而針葉林中磷酸酶活性略高。這是因為闊葉林土壤中易分解碳多，促進了微生物對易分解碳的利用，這體現(xiàn)了土壤底物即有機質(zhì)與酶活性之間的正相關(guān)關(guān)系。而磷酸酶與全磷顯著正相關(guān)，說明針葉林可能更需要磷。土壤SON與土壤葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶均呈正相關(guān)（圖2）。這說明，土壤SON受土壤碳氮轉(zhuǎn)化相關(guān)酶的影響，并且土壤碳氮轉(zhuǎn)化相關(guān)酶是強烈互相關(guān)聯(lián)的。土壤葡糖胺糖苷酶活性和親和力均與土壤全氮和微生物生物量碳氮均顯著正相關(guān)，表明了葡糖胺糖苷酶的重要來源，也為SON潛在來源提供驅(qū)動力。

土壤微生物生物量、微生物活性和微生物群落組成是影響土壤酶活性的關(guān)鍵因素[44]。酶活性伴隨著森林土壤微生物群落組成不同而造成差異，而來自凋落物層釋放的SON會引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變[45-46]。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤SON與土壤酶活性之間具有很好的相關(guān)性[11]，這些結(jié)果表明土壤SON受土壤酶的強烈影響。而本研究中土壤SON與土壤酶活性沒有顯著相關(guān)性，說明土壤酶對SON的影響可能更多取決于微生物生物量、微生物種類和活性。有研究證實，土壤SON周轉(zhuǎn)是土壤氮循環(huán)的重要途徑[47]，而SON是微生物最易利用的有機氮源，相關(guān)酶的活性有利于SON產(chǎn)生和代謝，因此SON和土壤酶相互關(guān)聯(lián)。亞熱帶是氮趨于飽和區(qū)[48]，但土壤轉(zhuǎn)化酶活性（尤其是葡糖胺糖苷酶）仍然比較高，表明森林土壤養(yǎng)分周轉(zhuǎn)速率依然很快。這其中，植物和微生物為了獲得更多的碳氮磷等營養(yǎng)元素，通過促進相關(guān)酶活性，增加分解土壤有機質(zhì)來滿足需求。季節(jié)變化和微生物群落變化也會影響土壤氮含量和酶活性[16]，因此，還需對季節(jié)動態(tài)和微生物做進一步研究，以便更好地探究土壤SON含量與酶活性的聯(lián)系，從而為揭示森林更替后不同林分對土壤氮循環(huán)的影響機制提供科學依據(jù)。

4 結(jié)論

亞熱帶不同演替階段的森林土壤中，闊葉林土壤SON、微生物生物量氮和土壤全氮明顯高于針葉林，而針葉林土壤SON和可溶性總氮顯著高于闊葉林，表明闊葉林比針葉林在保持土壤氮（特別是SON）方面更有效。闊葉林土壤中葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶活性均明顯高于針葉林，隨著植被恢復，土壤酶活性隨植被正向演替逐漸增大。土壤SON與葡糖胺糖苷酶、葡萄糖苷酶和木糖苷酶均呈正相關(guān)關(guān)系，表明隨著森林的正向演替，土壤SON含量呈上升趨勢且更易被利用。亞熱帶不同演替階段森林土壤可溶性有機氮和酶活性差異明顯，隨植被正向演替，SON含量增加，SON轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶活性增強，研究表明森林植被正向演替伴隨著土壤氮素養(yǎng)分快速循環(huán)過程。