下調miR-203靶向MEF2C/NF-κB抑制顳葉癲癇大鼠海馬膠質細胞的活化和炎癥反應

許 超 王 娟 劉 鋒 梁潔敏 劉偉偉

顳葉癲癇是成人最常見的藥物難治性癲癇[1～4]，長期發作會造成嚴重腦損害[5]。中樞神經系統內的星形膠質細胞與小膠質細胞在癲癇發生過程中有重要作用[6]。肌細胞增強因子2c（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）被認為是調節癲癇的重要轉錄因子之一，可調控多種受體和信號通路的表達[7]。研究證實，miR-203可抑制MEF2C的表達[8]。本研究通過建立顳葉癲癇大鼠模型，探討miR-203在顳葉癲癇疾病中的作用以及對MEF2C/NF-κB通路的影響，為深入闡述顳葉癲癇的發病機制以及治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雄性SD大鼠60只，8周齡，體重200～220 g，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司[許可證編號SCXK（京）2016-0006]。隨機分為假手術組、模型組、陰性對照組、miR-203抑制劑組。

1.2 大鼠癲癇模型的制作 隨機選擇10只大鼠作為假手術組，其余50只大鼠采用文獻[9]報道方法制作癲癇模型。用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，固定于立體定位儀上。以前囟為參考點，分別確定前、后囟在操縱器Z軸上的標度。用微量注射器將2.5 μl（0.5 μg/μl）海人酸注入大鼠左側海馬CA3區。假手術組相同部位注入等量的生理鹽水。造模時14只大鼠死亡，將剩余36只存活大鼠隨機分為模型組、陰性對照組和miR-203抑制組，每組12只。

1.3 干預方法 由上海基因化學有限公司構建一個攜帶miR-203 inhibitor的腺相關病毒（adeno-associated viral，AAV），陰性對照為空AAV載體。AAVmiR-203的滴度為1.0 ×1012，通過微量注射器以0.2 μl/min的速度注入左側海馬背側（前額后3.12 mm，中線外側3.0 mm，前額腹側3.4 mm）和海馬腹側（前額后5.04 mm，中線外側5.0 mm，前額腹側6.4 mm），每個位置注射3μl。

1.4 取材 干預7 d后，3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠后，4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦。取出右側海馬背側組織CA3區域，每組隨機選擇6只大鼠海馬組織，4℃下在研缽中進行組織勻漿，用于提取miRNA和總蛋白；另外6只大鼠組織用4%多聚甲醛固定24 h，用石蠟包埋，制備組織蠟塊。

1.5 實時熒光定量PCR檢測海馬組織miR-203水平取海馬CA3區組織勻漿，用TRIzol試劑（大連寶生生物科技有限公司）提取miRNA并逆轉錄得到cDNA。使用Applied Biosystems 7500實時PCR系統進行PCR引物擴增，循環條件為95℃10 min，95℃15 s，60℃60 s，共40個循環。用2-ΔΔCt方法進行量化分析。

1.6 ELISA法檢測海馬組織炎癥因子水平 取海馬CA3區組織勻漿，用ELISA試劑盒（上海碧云天有限公司）檢測白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNFα）TNF-α含量。

1.7 免疫熒光染色法檢測 將蠟塊進行冠狀面切片，經干燥、洗滌、滲透，5%山羊血清封閉，并與膠質纖維性原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP；1:500；英國Abcam公司）和CD11b/c（1:100；英國Abcam公司）共同孵育過夜。免疫標記切片用與Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 488結合的山羊抗鼠二抗清洗和孵化。DAPI復染核，使用Image J軟件進行人工計數。

1.8 TUNEL染色 按TUNEL試劑盒（武漢博士德公司）說明進行染色。取冠狀面切片脫蠟至水，室溫下用含0.1%Triton X-100的PBS洗滌5 min。組織干燥后，加入50 ml反應混合液（酶濃縮液：標記溶液=1:9），然后在37℃黑暗的濕箱中孵育1 h，置于熒光顯微鏡下觀察，選取5個隨機視野（×100）。凋亡率=凋亡細胞/總細胞數×100%。

1.9 免疫印跡法檢測蛋白表達 取海馬CA3區組織勻漿，冰上裂解、粉碎、離心，取上清，定量蛋白濃度。10%SDS-PAGE電泳分離后，轉至PVDF膜。用5%牛血清白蛋白封閉液封閉2 h。分別加入NF-κB p65及MEF2C蛋白抗體（1:500；英國Abcam公司）孵育過夜。用山羊抗小鼠IgG二抗孵育1 h后，顯影，對蛋白條帶進行半定量分析。

1.10 雙熒光素酶報告基因分析 用TargetScan數據庫（http://www.targetscan.org/vert_72/）預測miR-203的潛在目標后，使用overlapPCR法擴增得到含有miR-203結合位點的MEF2C野生型和突變型全長。構建pmirGIO-NC及pmirGIO-MEF2C重組載體。用Lipofectamine TM2000將重組報告載體和miR-203 mimics或miR-NC轉染入HEK293T細胞中培養24 h后，采用DualGlo雙熒光素酶檢測系統檢測各組的熒光強度。

1.11 統計學處理 用SPSS 21.0 軟件進行處理；計量資料以±s表示，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗；以P＜0.05 代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 海馬組織miR-203的表達變化 與假手術組（1.00 ±0.04 ）相比，模型組（3.45 ±0.27 ）和陰性對照組（3.53 ±0.08 ）大鼠海馬組織miR-203表達量明顯升高（P＜0.05），而模型組和陰性對照組無統計學差異（P＞0.05）。與模型組和陰性對照組相比，miR-203抑制劑組海馬組織miR-203相對表達量（1.60 ±0.03 ）明顯降低（P＜0.05）。

2.2 海馬組織炎癥因子的含量變化 與假手術組相比，模型組和陰性對照組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著增加（P＜0.05），而模型組和陰性對照組無統計學差異（P＞0.05）。與模型組和陰性對照組相比，miR-203抑制劑組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

2.3 海馬組織星型膠質細胞和小膠質細胞的活化情況 與假手術組相比，模型組和陰性對照組GFAP和CD11b/c陽性細胞數量明顯增多，而模型組和陰性對照組無統計學差異（P＞0.05），說明海馬區放射層星形膠質細胞或小膠質細胞呈高度活化狀態。與模型組和陰性對照組相比，miR-203抑制劑組大鼠海馬組織GFAP和CD11b/c陽性細胞數量明顯減少（P＜0.05）。見圖2。

2.4 海馬組織神經元凋亡情況 與假手術組相比，模型組和陰性對照組大鼠海馬TUNEL陽性細胞數量明顯增多（P＜0.05），而模型組和陰性對照組無統計學差異（P＞0.05）。與模型組和陰性對照組相比，miR-203抑制劑組大鼠海馬TUNEL陽性細胞數量則明顯減少（P＜0.05）。見圖3。

圖1 各組大鼠海馬組織炎癥因子的含量比較

2.5 海馬組織MEF2C/NF-κB通路相關蛋白表達情況 與假手術組相比，模型組和陰性對照組大鼠海馬組織MEF2C蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）、NF-κB p65蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）；而模型組和陰性對照組無統計學差異（P＞0.05）。與模型組和陰性對照組相比，miR-203抑制劑組大鼠海馬組織MEF2C蛋白表達量顯著升高、NF-κB p65蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）。見圖4。

2.6 miR-203靶基因預測及雙熒光素酶報告基因分析 與模擬對照組比較，miR-203 mimics和野生型MEF2C（MEF2C-3'UTR-WT）共轉染可明顯抑制熒光素酶活性（P＜0.05），但與突變型MEF2C共轉染則對熒光素酶活性無影響（P＞0.05）。見圖5。

3 討論

神經膠質細胞的激活和增生是目前已經明確的癲癇病理特征之一，會改變血腦屏障的完整性、離子和神經遞質的穩態，進而引起炎癥反應，導致神經興奮過度和癲癇活動的產生和擴散。微小核糖核酸是調節下游編碼基因轉錄和翻譯的重要介質，并且在癲癇的病因和發展中起關鍵的作用。文獻報道，子癇前期miR-203表達的增加，會促進炎癥反應[10]；沉默miR-203表達，可以上調甘氨酸受體-β的表達，對慢性癲癇小鼠有一定的治療作用[11]。本研究采用大鼠海馬內注射海人酸建立癲癇動物模型，使用AAV構建AAV-miR-203 inhibitor，并注入左側海馬區沉默miR-203的表達，結果顯示miR-203低表達組大鼠海馬組織神經元凋亡數量明顯減少，MEF2C蛋白表達水平明顯上調，NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低，炎癥因子分泌明顯減少。這說明下調miR-203表達，可能通過調節MEF2C相關信號通路的轉導，抑制海馬膠質細胞的激活。

神經膠質細胞對維持神經元的生存環境起著重要的作用。當星形膠質細胞對谷氨酸或γ氨基丁酸的攝取能力發生改變時，可導致癲癇發作，主要病理改變包括海馬硬化、神經元丟失以及腦組織內星形膠質細胞和小膠質細胞細胞增生[12]。當癲癇發作時，GFAP表達明顯增加，同時伴隨著星形膠質細胞異?；罨痆13]。與星形膠質細胞有所不同的是，在顳葉癲癇潛伏期時，小膠質細胞CD11b/c已經出現高表達，同時細胞增殖活性明顯增加。本研究發現模型組大鼠海馬組織星形膠質細胞和小膠質細胞都出現異?；罨F象，GFAP或CD11b/c陽性表達細胞數量明顯增多；抑制miR-203表達后，GFAP或CD11b/c陽性表達細胞數量均明顯減少。除此以外，模型組大鼠神經元凋亡明顯，這也是顳葉癲癇誘導神經元損傷的重要機制之一，而miR-203低表達組大鼠海馬組織神經元細胞凋亡數量顯著減少。這說明抑制miR-203表達可減輕癲癇引起的海馬組織神經元損傷。

圖2 各組大鼠海馬組織GFAP和CD11b/c免疫熒光染色分析（×400）

圖3 各組大鼠海馬組織神經元凋亡情況（×100）

圖4 各組大鼠海馬組織MEF2C、NF-κB p65蛋白表達情況

圖5 生物信息學和雙熒光素酶報告基因分析miR-203和MEF2CmRNA的靶向關系

另外，小膠質細胞和星形膠質細胞過度活化共同產生大量炎性細胞因子[14]，而炎癥因子的大量分泌，一方面會進一步增加神經元的興奮性，提高癲癇的易感性；另一方面，也是引起神經元凋亡的重要原因之一[15]。因而，控制炎性因子的釋放也許是顳葉癲癇的治療手段之一。本研究模型組大鼠觀察到的促炎性細胞因子水平的增加；下調miR-203表達，明顯降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平，說明抑制miR-203表達在控制顳葉癲癇的炎癥反應中也起著積極的作用。

MEF2轉錄因子家族在許多生理和病理過程中發揮關鍵作用，包括神經發育、心臟發育、神經退行性疾病和癌癥等[16]。MEF2C在中樞神經元系統中呈高表達，具有反式激活作用和DNA結合活性，通過調節內皮細胞的NF-κB表達，進而抑制炎癥反應[17]。NF-κB與是細胞中具有多向轉錄調節作用的一種蛋白質[18]。炎癥因子可激活NF-κB p65，進而刺激成纖維細胞、內皮細胞等分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子，最終導致炎癥反應發生、發展。何乾超等[19]研究表明NF-κB信號通路激活與癲癇發作密切相關。本研究證實miR-203對于MEF2C基因的轉錄翻譯有一定的靶向抑制作用，miR-203低表達組大鼠海馬組織MEF2C蛋白表達量顯著升高，同時NF-κB p65蛋白表達量明顯降低。這說明下調miR-203對于MEF2C/NF-κB信號通路有一定的調控作用。這可能是下調miR-203表達保護海馬組織膠質神經元損傷和抑制炎癥反應的重要機制之一。

綜上所述，miR-203在顳葉癲癇大鼠海馬組織中表達上調，抑制miR-203表達后，可通過靶向調節下游MEF2C/NF-κB信號通路，抑制顳葉癲癇大鼠海馬膠質細胞的活化和炎癥反應。