miR-103a-3p過表達(dá)靶向負(fù)調(diào)控PDK4抑制膠質(zhì)瘤生長及侵襲

郭 放 萬學(xué)鋒 劉獻(xiàn)志 楊 強(qiáng) 李太平

膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，具有高復(fù)發(fā)性、高致殘性、高病死率的特點，嚴(yán)重危害人類健康[1]。目前，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但遺傳易感、環(huán)境污染與其發(fā)病關(guān)系密切[2]。miR-103a-3p參與卵巢癌的遷移和侵襲過程[3]。丙酮酸脫氫酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）是線粒體呼吸作用向細(xì)胞質(zhì)糖酵解代謝轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶，其過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及耐藥性[4]。利用miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫對miR-103a-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PDK4可能是其潛在的靶基因。本文探討過表達(dá)miR-103a-3p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 將鼠源性C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞（美國模式培養(yǎng)物集存庫）培養(yǎng)于含10%胎牛血清的完全RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）至對數(shù)生長期，0.25%胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）消化制成單細(xì)胞懸液。參照試劑盒操作說明采用Lipofectamine?2000（美國Thermo Fisher公司）將質(zhì)粒miR-103a-3p mimics（上海吉凱基因技術(shù)有限公司）、mimics-NC（上海吉凱基因技術(shù)有限公司）、pcDNA-NC（美國Invitrogen公司）、pcDNA-PDK4（美國Invitrogen公司）分別轉(zhuǎn)染鼠源性C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡下觀察。若發(fā)出綠色熒光信號，則視為轉(zhuǎn)染陽性，測序驗證穩(wěn)定表達(dá)后收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒分為miR-NC組、mimics組、pcDNA組、PDK4組、mimics+PDK4組、control組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒）。

1.2 RT-PCR檢測miR-103a-3p及PDK4、Ki-67、PCNA mRNA表達(dá) 采用TRIzol試劑盒（美國Thermo Fisher公司）提取總RNA，紫外分光光度計測定濃度，并用凝膠電泳檢測RNA完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Fisher公司）說明書合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系（20μl）：2×miRNA反應(yīng)混合液10μl，0.1%BSA 2μl，miRNA PrimeScript?RT酶混合物2μl，總RNA 1μl，RNase Free ddH2O補(bǔ)充至20μl。反應(yīng)條件：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃、30 min。根據(jù)熒光定量PCR試劑盒（美國TAKALA公司）說明書操作，PCR體系20μl：SYBR?Prmix Ex TapⅡ（2×）10μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μl，c DNA 2μl，ddH2O 6.8 μl。PCR反應(yīng)參數(shù)：50℃激活聚合酶5 min，95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火35 s，70℃延伸5 s，反應(yīng)進(jìn)行40個循環(huán)。溶解曲線繪制：95℃、15 s，60℃、60 s，85℃、15 s，60℃、15 s。miR-103a-3p以U6為內(nèi)參基因，PDK4、Ki-67、PCNA以β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。每個樣孔設(shè)置3個復(fù)孔。用2-△△Ct法計算相關(guān)基因表達(dá)量。

1.3 免疫印跡法檢測PDK4蛋白表達(dá)水平 按試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書提取細(xì)胞總蛋白，BCA法（上海碧云天生物技術(shù)公司）測定蛋白濃度后，SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（美國Thermofisher公司），5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗大鼠PDK4、ACTIN一抗（1:500；美國Abcam公司）4℃孵育過夜，TBS緩沖液（美國Thermofisher公司）漂洗40 min后，加入HRP標(biāo)記的二抗（1:500；美國Abcam公司）常溫孵育1 h，TBST緩沖液沖洗40 min，ECL顯影并拍照。

1.4 雙熒光素酶報告試驗驗證miR-103a-3p與PDK4的靶向關(guān)系 將含有PDK4結(jié)合位點的miR-103a-3p 3'-UTR片段及其突變體插入到pLV-EGFP（2A）Puro載體熒光素酶報告基因的下游，分別命名為PDK4 wt和PDK4 mut。對構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序結(jié)果符合要求的質(zhì)粒分別和miR-103a-3p mimics及mimics-NC共轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞。轉(zhuǎn)染完成后24 h后裂解細(xì)胞，進(jìn)行熒光素酶活性檢測。

1.5 細(xì)胞增殖能力的檢測 將對數(shù)生長期C6細(xì)胞以1×105個/ml密度接種到96孔板中，參考文獻(xiàn)[5]報道方法應(yīng)用Cell-LightTM EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒（廣州銳博生物技術(shù)有限公司）檢測細(xì)胞增殖能力。KR刺激24 h后，每孔滴加現(xiàn)配的含EDU（50μmol/L）的培養(yǎng)基孵育2 h，加入含4%多聚甲醛的PBS細(xì)胞固定液室溫孵育30 min，然后滴加甘氨酸（2 g/L）孵育5 min，再加入PBS清洗5 min。之后，加入1×Apollo染色反應(yīng)液室溫遮光孵育30 min，用含0.5%TritonX-100的PBS溶液清洗3次（10 min/次），再用甲醇清洗2次（5 min/次）、PBS清洗1次（5 min）。加入DAPI反應(yīng)液室溫遮光孵育30min后，PBS清洗3次。熒光顯微鏡觀察，隨機(jī)選擇5個視野，計算EDU染色陽性細(xì)胞比例。

表1 引物序列

1.6 細(xì)胞凋亡水平的檢測 取C6細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/m l，1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，PBS重懸沉淀，加入AnnexinⅤ-FITC緩沖液混勻，再加入AnnexinⅤ/FITC+PI混合，室溫避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞侵襲能力的檢測 收集對數(shù)生長期C6細(xì)胞，PBS緩沖液沖洗后，用無胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，制成1×105個/ml細(xì)胞懸液。取200μl細(xì)胞懸液放置在鋪好Matrigel膠（美國Corning公司）的Transwell小室內(nèi)，再將小室放置到含100 m l/L胎牛血清培養(yǎng)液的24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，用PBS淋洗，并利用棉簽輕柔的擦去上層未穿膜的細(xì)胞和基質(zhì)膠，用冰甲醛對濾膜進(jìn)行固定后，結(jié)晶紫染色30 min，倒置顯微鏡觀察、拍照。

1.8 裸鼠移植瘤試驗 將40只裸鼠[5周齡SPF級雄性BALB/c裸鼠，體重（16.37 ±1.07 ）g，購自北京阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2014-0009]]隨機(jī)等分為Control與mimics組，每組20只。參考文獻(xiàn)[6]報道方法建立移植瘤模型。收集對數(shù)生長期C6細(xì)胞和轉(zhuǎn)染miR-103a-3p mimics質(zhì)粒的C6細(xì)胞，注射于裸鼠右腋下皮下。每5 d隨機(jī)處死3只裸鼠，30 d時處死所有裸鼠，分離腫瘤并測定腫瘤質(zhì)量及體積，并取腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色觀察Ki-67、Vimentin表達(dá)，RT-PCR檢測miR-103a-3p、PDK4 mRNA水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件分析；計量資料以±s表示，采用單因素方差分和q檢驗；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-103a-3p過表達(dá)靶向負(fù)調(diào)控C6細(xì)胞PDK4表達(dá)mimics組C6細(xì)胞PDK4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著低于control組（P＜0.05），mimics+PDK4組細(xì)胞PDK4 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于mimics組（P＜0.05）。共轉(zhuǎn)染miR-103a-3p mimics和PDK4 wt細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染mimics-NC和PDK4 wt細(xì)胞（P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染miR-103a-3p mimics和PDK4 mut細(xì)胞熒光素酶活性和共轉(zhuǎn)染mimic NC和PDK4 mut細(xì)胞無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見圖1。

2.2 miR-103a-3p過表達(dá)靶向負(fù)調(diào)控PDK4表達(dá)抑制C6細(xì)胞增殖mimics組C6細(xì)胞增殖活性、Ki-67和PCNA mRNA水平均明顯低于control組（P＜0.05），PDK4組C6細(xì)胞增殖活性、Ki-67和PCNA mRNA水平均明顯高于control組（P＜0.05），mimics+PDK4組C6細(xì)胞增殖活性、Ki-67和PCNA mRNA水平均明顯低于mimics組（P＜0.05）。見圖2。

2.3 miR-103a-3p過表達(dá)靶向負(fù)調(diào)控PDK4表達(dá)促進(jìn)C6細(xì)胞凋亡mimics組C6細(xì)胞凋亡率顯著高于control組（P＜0.05），PDK4組C6細(xì)胞凋亡細(xì)率明顯低于control組（P＜0.05），mimics+PDK4組C6細(xì)胞凋亡率著低于mimics組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 miR-103a-3p過表達(dá)靶向負(fù)調(diào)控PDK4表達(dá)抑制C6細(xì)胞侵襲mimics組C6細(xì)胞侵襲能力、Ncadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平均明顯低于control組（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯高于control組（P＜0.05）；PDK4組C6細(xì)胞侵襲能力、Ncadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平均明顯高于control組（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯低于control組（P＜0.05）；mimics+PDK4組C6細(xì)胞侵襲能力、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平均明顯高于mimics組（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯低于mimics組（P＜0.05）。見圖4。

2.5 miR-103a-3p過表達(dá)靶向負(fù)調(diào)控PDK4表達(dá)抑制C6細(xì)胞裸鼠體內(nèi)移植瘤生長mimics組移植瘤重量、體積、PDK4 mrNA水平、Ki-67和Vimentin表達(dá)陽性率均明顯低于control組（P＜0.05），miR-103a-3p水平顯著高于control組（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

miR-103a-3p屬于miR-103a前體3′端產(chǎn)物，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤及神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中呈低表達(dá)，可下調(diào)胚胎前腦鋅指蛋白1/細(xì)胞分裂周期磷酸酶24A途徑，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，并促進(jìn)其凋亡[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，鼠源性膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞過表達(dá)miR-103a-3p后，細(xì)胞PDK4 mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平均顯著降低，進(jìn)一步雙熒光素酶報告實驗證實miR-103a-3p與PDK4的靶向負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖1 過表達(dá)miR-103a-3p靶向負(fù)調(diào)控體外培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞PDK4表達(dá)

圖2 過表達(dá)miR-103a-3p靶向負(fù)調(diào)控PDK4抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性

圖3 過表達(dá)miR-103a-3p靶向負(fù)調(diào)控PDK4促進(jìn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

圖4 過表達(dá)miR-103a-3p靶向負(fù)調(diào)控PDK4抑制C6細(xì)胞侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白的表達(dá)

本研究結(jié)果還顯示，過表達(dá)miR-103a-3p后，C6細(xì)胞增殖活性顯著降低，C6細(xì)胞Ki67、PCNA的mRNA相對表達(dá)水平均顯著降低；而共同過表達(dá)miR-103a-3p和PDK4后，C6細(xì)胞Ki67、PCNA的mRNA相對表達(dá)水平明顯升高；另外，過表達(dá)miR-103a-3p后，C6細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯升高，而共同過表達(dá)miR-103a-3p和PDK4后，C6細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。這可能與Warburg效應(yīng)有關(guān)。在氧氣足夠的情況下，腫瘤細(xì)胞依舊通過糖酵解來獲取能量，這種代謝的重新編程被稱為Warburg效應(yīng)[8]。PDK4為細(xì)胞糖酵解過程的關(guān)鍵激酶[9]，抑制其活性，可抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解過程，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)障礙，從而抑制C6細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

膠質(zhì)瘤具有高侵襲性的特點。EMT與惡性腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系[10]，因此通過分析EMT過程來了解miR-103a-3p的調(diào)控機(jī)制有積極意義。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-103a-3p后，C6細(xì)胞侵襲能力及EMT指標(biāo)蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明miR-103a-3p負(fù)調(diào)控PDK4抑制C6細(xì)胞的EMT進(jìn)程，從而降低其侵襲能力。線粒體呼吸對腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲起著決定性的作用，雖然腫瘤細(xì)胞在Warburg效應(yīng)下偏向于糖酵解獲取能量，但當(dāng)PDK4這一糖酵解關(guān)鍵激酶下調(diào)后，會改變丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)的過程，而這一過程是EMT的關(guān)鍵步驟[11]。因此，我們推測miR-103a-3p負(fù)調(diào)控PDK4后，使線粒體呼吸代謝過程發(fā)生改變，調(diào)控EMT進(jìn)程關(guān)鍵蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制C6細(xì)胞的侵襲能力。

本研究進(jìn)行了裸鼠異體移植瘤實驗，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-103a-3p后，移植瘤的體積及質(zhì)量均明顯低于對照組，Ki67、Vimentin陽性表達(dá)率也顯著降低，與體外實驗一致，表明過表達(dá)miR-103a-3p能夠一直移植瘤生長。這與Chen等[12]研究一致。

綜上所述，過表達(dá)miR-103a-3p通過靶向抑制PDK4表達(dá)，一方面抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制膠質(zhì)瘤生長；另一方抑制膠質(zhì)瘤EMT過程，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。

圖5 過表達(dá)miR-103a-3p抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤生長