膠質瘤組織UCH37表達水平與病人預后的相關性

喬建新 劉熙鵬 段升強 劉 明 曹 兵

膠質瘤是常見的中樞神經系統腫瘤，在腦腫瘤中占比超過50%，約82%為膠質母細胞瘤，具有侵襲性強、復發率高的特點，5年生存率僅4.7 %[1]。膠質瘤發生、進展、復發機制復雜，與多種蛋白、基因改變有關。研究表明，去泛素化酶與泛素化酶相互作用，對癌基因、抑癌基因具有調節作用，參與腫瘤進展[2]。泛素化羧基末端水解酶37（ubiquitin C-terminal hydrolase 37，UCH37）是去泛素化酶的重要組成部分，與多種惡性腫瘤有關[3～5]。本文探討腦膠質瘤組織UCH37表達變化及其與病人預后的關系。

1 資料與方法

1.1 標本來源 納入標準：年齡≥18歲，病理證實為腦膠質瘤；手術前后病例資料齊全；精神狀態、認知功能正常，能配合檢查；知曉研究內容，并簽署同意書。排除標準：患有其他部位原發性腫瘤；術前進行放、化療；既往有顱腦損傷史；患肝、腎、心等臟器疾病。

選取2017年6月至2019年6月手術切除的腦膠質瘤組織104例，其中男55例，女49例；年齡40～73歲，平均（56.49 ±12.15 ）歲；腫瘤直徑1～6 cm，平均（3.23 ±1.21 ）cm；WHO分級Ⅰ級32例，Ⅱ級43例，Ⅲ級29例；星形膠質細胞瘤48例，少突膠質細胞瘤27例，室管膜瘤18例，其他11例；腫瘤全切除49例，非全切除55例；術后放療81例；發生癲癇20例。選取64例瘤旁組織作為對照。

1.2 免疫組化法檢測UCH37蛋白表達水平 組織塊制備成石蠟塊，切片厚度4μm。脫蠟后，3%過氧化氫滅火內源性酶，PBS清洗3次。用PBS在高壓下反應3 min、冷卻20 min進行抗原修復。5%胎牛血清封閉10 min，加入一抗4℃下過夜，PBS清洗3次，加入二抗，37℃反應30 min。加入鏈球菌親和素（經辣根酶化后）37℃反應30 min，PBS清洗4次。DAB顯色，經蘇木素復染后，顯微鏡下觀察。

根據文獻[6]報道方法判定染色結果：選擇高倍鏡（×400）4個視野，進行染色計分（無染色、輕微褐色、中度褐色以及深褐色分別計0、1、2、3分）和陽性細胞率計分（陽性細胞≤20%、20%～75%、75%～90%、＞90%分別計0、1、2、3分），兩項評分的乘積即為目的基因表達分值，0～4分低表達，6～9分高表達。

1.3 qRT-PCR檢測UCH37 mRNA表達水平 提取蠟塊方標本總RNA，然后逆轉錄成cDNA，參考說明書進行擴增，反應條件為95℃3 min，95℃20 s，60℃20s，68℃20s，共30個循環。PCR擴增引物由賽默飛世爾公司設計：UCH37上游引物為5'-TGTCTCATGGAAAGCGACCC-3'，下 游 為5'-GCCACTTGAAAAGAAAAATTAACCC-3'。以β-actin為內參，上游引物為5'-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3'，下游為5'-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3'。通過2-△△Ct值表示UCH37基因相對表達量。

1.4 隨訪 術后隨訪18個月，記錄生存、死亡情況。1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0 軟件分析；計數資料行χ2檢驗；計量資料以表示，用t檢驗；采用多因素logistic回歸分析死亡的危險因素；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線；繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析UCH37評估預后的效果；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦膠質瘤組織UCH37的表達情況 腦膠質瘤組織UCH37高表達率（59.62%，62/104）明顯高于瘤旁組 織（17.19 %，11/64；P＜0.05 ）。腦 膠 質 瘤 組 織UCH37 mRNA表達量[（2.68 ±0.75 ）]明顯高于瘤旁組織（0.83 ±0.09 ；P＜0.001 ）。

2.2 預后影響因素分析104例中，死亡20例，存活84例。單因素分析顯示，年齡、腫瘤直徑、病理分級、腫瘤切除程度、UCH37表達水平、顱內壓增高與術后死亡有關（P＜0.05；表1）。多因素logistic回歸分析顯示，年齡≥60歲、腫瘤直徑≥3 cm、病理分級Ⅲ級、腫瘤非全切除、UCH37高表達是腦膠質瘤術后死亡的獨立危險因素（P＜0.05；表2）。

2.3 UCH37表達水平與病人生存期的關系104例中，UCH37高表達62例，低表達42例。高表達組中位生存期（9個月）較低表達組（13個月）明顯縮短（P＜0.05，圖1）。

2.4 UCH37 mRNA表達量對預后的評估價值ROC曲線分析顯示，UCH37 mRNA評估術后病人死亡的最佳界值為2.725 ，曲線下面積為0.797 （95%置信區間0.695 ～0.899 ），敏 感 度 為70.00 %，特 異 度 為70.10%。見圖2。

表1 本文104例膠質瘤預后影響因素的單因素分析（例）

表2 本文104例膠質瘤預后影響因素的單因素Cox比例回歸風險模型分析

圖1 膠質瘤組織UCH37表達水平與病人預后關系的生存曲線分析

圖2 膠質瘤組織UCH37 mRNA水平評估病人術后死亡的ROC曲線

3 討論

目前，膠質瘤的發病機制尚未徹底明確，但與家族遺傳、離子輻射等有關，而腫瘤侵襲機制主要與機體免疫力、腫瘤微環境等有關[7]。腦膠質瘤的手術切除具有一定的難度，部分病人還會出現化療耐藥、放療抵抗等情況，導致腫瘤復發風險增高，預后欠佳[8]。明確腦膠質瘤進展機制，可為膠質瘤的治療提供指導。近年來，臨床研究認為，UCH37參與腫瘤進展。王麗娟等[9]發現，UCH37在惡性黑素瘤組織中呈高表達，其高表達與淋巴結轉移、腫瘤分期密切相關。劉華柱和鄧明明[10]研究提示，結腸癌組織UCH37為高表達，對腫瘤細胞增殖有促進作用。本文結果顯示，膠質瘤組織UCH37呈高表達。UCH37是泛素羧基末端水解酶家族的一員，能夠對蛋白遠端的多聚亞基進行拆分，使蛋白質降解受到抑制。研究表明，UCH37能通過阻止泛素化調節因子2與Smad7相結合，抑制二者復合物形成，使Ⅰ型轉化生長因子-β（transfor ming growth factor-β，TGF-β）受體免于泛素化，導致TGF-β表達上調[11]。李欽濤等[12]研究顯示，惡性膠質瘤組織TGF-β表達水平較瘤旁組織明顯增高。另有學者發現，正常腦組織無TGFβ表達或表達量極低，而腦膠質瘤可見TGF-β過表達，PI3K、Smad等信號通路發生變異后，能誘導TGF-β促進腫瘤細胞分化、增殖，增強膠質瘤的侵襲性與惡變程度[13]。這提示膠質瘤UCH37過表達，可能通過上調TGF-β表達，促進膠質瘤發生、進展。

UCH37對腦膠質瘤預后有較大影響。本文結果顯示，UCH37高表達是腦膠質瘤病人術后死亡的獨立危險因素，而且UCH37高表達病人生存期明顯縮短，膠質瘤組織UCH37 mRNA水平對預后評估效果較好。這表明UCH37與腦膠質瘤預后有關。UCH37促進腫瘤細胞增殖的機制可能與其底物相結合有關，促使泛素分子水解，與之結合的底物包括轉錄因子、酶等，部分底物是抑癌基因或癌基因產物，一旦UCH37與癌基因底物結合，則能促進腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞凋亡，導致病情進一步惡化，增加死亡風險[14]。研究表明，UCH37可以對Tcf7DNA結合通路進行調控，使Wnt信號通路活化，發揮促腫瘤進展作用[15]。這表明UCH37高表達能加速腫瘤惡化，這對病人預后不利。

綜上所述，腦膠質瘤組織UCH37呈高表達，是影響術后病人死亡的獨立危險因素，臨床可通過測定UCH37水平對預后進行預測。