高壓氧治療對癲癇大鼠血清白細胞介素1β、白細胞介素2、白細胞介素8、腫瘤壞死因子α水平及海馬神經元Bax及Bcl-2表達的影響*

崔 陽

（河北醫科大學附屬燕達醫院神經外科，廊坊 065201）

癲癇發病后往往會使患者出現不同程度的腦功能異常[1-2]。根據最新WHO 數據顯示[3]，癲癇患病率為3.5%～4.8%。因此，對于癲癇病的病因以及特異性藥物的開發或臨床治療手段的尋找至關重要。研究表明機體免疫系統功能的異常與癲癇的發病原因存在一定的相關性[4]。關于癲癇發病機制的假說主要集中于離子通道或神經信號通路等[5-6]。研究顯示機體免疫系統是癲癇的發病基礎，并顯示大量的細胞因子如白介素家族蛋白或某些炎性分子在癲癇發病過程中擔任極其重要的角色，其中對白細胞介素（interleukin，IL）1β（IL-1β）、IL-2、IL-8 的研究相對較為豐富。炎性因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）也共同參與了癲癇的形成，并與神經系統的異常變化密切相關。凋亡蛋白包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，其基因控制著海馬神經元的正常或缺陷，因此凋亡蛋白的上調或下調也控制著癲癇的發生和發展[7]。高壓氧治療能明顯改善組織缺血缺氧，改善炎性反應，降低對組織的免疫損傷，保護神經功能的作用。因此本研究旨在通過探討高壓氧對癲癇神經免疫的影響，為高壓氧對癲癇的治療提供部分理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究選擇8 ～10 周齡的健康雄性SD 大鼠36只，體質量為180 ～220 g，實驗動物購于北京維通利華實驗動物中心。

1.2 試劑和儀器

氯化鋰、匹羅卡品、水合氯醛、ELISA 試劑盒購自江蘇寶萊生物科技有限公司；RIPA 細胞/組織裂解液購自上海生工有限公司；4%多聚甲醛、蔗糖、YLC 0.5/0.8 型高壓氧艙購自上海701 所；Statfax 4200 型酶標儀購自美國AWARENESS 公司；Microfuge 20R 型冷凍離心機購自美國貝克曼庫爾特有限公司；DMI3000B 型熒光顯微鏡購自德國Leica 公司。

1.3 實驗分組與癲癇模型制備

采用隨機數字法將36 只SD 大鼠進行編號，1 ～12 號實驗動物設置為空白對照組，剩余24 只動物接受匹羅卡品法建立癲癇模型[8]，建模過程如下：腹腔注射氯化鋰溶液 （125 mg/kg），18 h 或20 h 后再腹腔注射30 mg/kg 匹羅卡品溶液，30 min后，根據Racine 評分標準對大鼠行為評價，如評價等級達到4 或5 級則認為達到癲癇標準，如無癲癇發作或未達到4 或5 級則再次注射匹羅卡品，直至達到癲癇標準，最多注射次數為4 次。將24 只癲癇建模成功的動物隨機分為2 組，分別為模型組和干預組，每組12 只。

1.4 治療方法

對干預組動物進行高壓氧治療干預，具體操作如下：首先對高壓氧艙各項參數進行設定，將氧艙內設置為高氧氣濃度（80%～90%），每日進行1 次治療，30 min，7 d 1 個療程，每只實驗動物均接受21 次高壓氧治療。每個療程治療后，停止3 d，以防動物在治療期間出現氧氣中毒或減壓疾病[9]。

1.5 標本采集與處理

高壓氧治療后將全部動物行腹腔注射10%的水合氯醛實施麻醉以采集標本。將實驗動物四肢固定于解剖板，用剪刀小心剪開腹腔，利用導管負壓狀態下抽取下腔靜脈血3 ～5 mL，3 000 ～3 500 r/min 冷凍離心20 min，收集血清并于-20℃貯存。采用ELISA 法對實驗動物血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 水平進行測定。將動物頸椎脫臼法處死，快速取海馬組織，部分海馬組織進行勻漿，并用RIPA 細胞/組織裂解液裂解，貯存于-80℃，用于免疫印跡檢測。剩余部分海馬組織用PBS 洗滌后進行4%多聚甲醛固定，濃度為30%的蔗糖溶液脫水，待組織下沉后可進行中性樹脂包埋，冷凍切片機制作超薄切片后貯存于-80℃，用于免疫熒光染色檢測[10-11]。

1.6 ELISA 檢測

參照ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 的表達量。

1.7 免疫印跡檢測[12]

在癲癇發作后不同時間點分別斷頭取血，分離血清。同時取腦，迅速剝離海馬，勻漿，取上清，將血清和勻漿液置于-70℃待測。RIPA 細胞/組織裂解液后的海馬組織樣品與等體積的2×上樣緩沖液，混勻后100℃煮樣10 ～15 min，待SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。首先配制12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠對總蛋白進行分離，濃縮膠電壓設置為70 ～80 V，待電泳至分離膠時可調節電壓至120 ～130 V，根據蛋白Marker 條帶顯示至凝膠底部時停止電泳。電泳結束后將凝膠蛋白轉移至PVDF 膜，轉膜參數設置為恒定電流300 mA，時間80 ～90 min，總蛋白轉移至PVDF 膜后利用5%的脫脂牛奶封閉非特異性抗原2 h，根據Marker 條帶蛋白大小顯示針對Bax、Bcl-2 蛋白進行鼠抗或兔抗過夜孵育，PBST 洗滌PVDF 膜3 次，每次5 ～10 min 即可，然后進行HRP 標記的羊抗鼠或羊抗兔抗體進行二抗孵育，室溫1 ～2 h 即可進行ECL 發光檢測，所得條帶使用Image J 軟件定量或分析。

1.8 免疫熒光染色檢測[13]

將制備的冷凍切片取出，PBS 漂洗3 次，每次漂洗10 ～15 min，為消除內源性過氧化氫酶活性加入0.3%過氧化氫，再次PBS 漂洗3 次，每次漂洗10 ～15 min，然后利用濃度為5%的牛血清白蛋白孵育2 h 以封閉非特異性抗原，封閉后無需PBS 漂洗可直接進行Bax 和Bcl-2 鼠抗或兔抗孵育，4℃，24 h，PBS 漂洗3 次，每次漂洗3 ～5 min，使用帶有熒光標記的羊抗鼠或羊抗兔HRP室溫孵育1 ～2 h，即可于熒光顯微鏡下進行拍照觀察。利用Image J軟件分析陽性細胞數目，總細胞數至少觀察200個，每組重復3次，取平均值比較。

1.9 統計學處理

本研究采用統計軟件SPSS 19.0 處理數據，以百分比率（%）表示計數資料，行χ2檢驗；以±s表示計量資料，行t檢驗，當P＜0.05 時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高壓氧治療對癲癇大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 表達的影響

與空白對照組相比，癲癇模型組大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α表達水平均顯著升高，IL-2表達水平明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；經過高壓氧治療干預后，與癲癇模型組相比，實驗大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α表達水平顯著降低，IL-2表達水平明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。因此，癲癇病的發生發展與白介素家族基因表達水平具有一定相關性（圖1）。

圖1 高壓氧治療對癲癇大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α 表達的影響

2.2 各組海馬神經元Bax 和Bcl-2 的表達變化

免疫印跡檢測結果顯示，空白對照組SD 大鼠海馬組織Bax 蛋白光密度值最低，癲癇模型組大鼠海馬神經元Bax 蛋白表達顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；經過高壓氧治療干預后，Bax 蛋白水平顯著下調。與空白對照組相比，癲癇模型組抗凋亡蛋白Bcl-2 在海馬神經元中表達顯著下降，經過高壓氧治療干預后，該蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。因此，海馬神經元凋亡因子的表達預示癲癇疾病的發作過程（圖2）。

圖2 免疫印跡檢測Bax 和Bcl-2 光密度的定量結果

2.3 海馬神經元Bax 和Bcl-2 的相對變化情況

免疫熒光染色檢測結果顯示，與空白對照組相比，癲癇模型組大鼠神經元Bax 陽性神經元數量顯著升高，而Bcl-2 陽性神經元數量顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；經過高壓氧治療干預后，Bax 陽性神經元數量明顯降低，而Bcl-2 陽性神經元數量明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。因此，該結果也進一步證明了海馬神經元Bax 和Bcl-2 的相對變化與癲癇具有相關性（圖3）。

圖3 免疫熒光檢測Bax（A1～C1）和Bcl-2（A2～C2）陽性神經元數

3 討論

IL-1β 是一種細胞調節因子，屬于白介素-1 家族成員之一，許多免疫系統異常疾病均與該調節因子的異常表達或分泌相關[14-15]。根據最新研究表明，與正常人群相比，癲癇患者外周血血清中IL-1β 的表達水平明顯升高，同時該調節因子的表達水平甚至可以對神經元受損程度提供一定的參考依據。IL-1β 在癲癇患者中顯著升高主要原因之一為該因子可在體內刺激分泌細胞分泌，并釋放其他炎性因子，以促進癲癇的發生發展。IL-2 是機體在受到外界應激時產生的糖蛋白，能夠刺激并促進T 細胞生長，因此該細胞調節因子的主要功能為調節人體免疫反應以應對不良外界條件[16-17]。癲癇患者血清中IL-2 水平與正常人相比明顯較高，因此大量國內外研究證實該調節因子通過調節免疫系統參與癲癇的發病過程。IL-8、TNF-α 是2 種機體分泌的炎性因子，能夠導致局部組織的炎癥反應，目前關于兩者與癲癇之間關系的研究還相對較少[18]。近年來隨著對癲癇深入研究表明，該疾病發病過程中具有細胞凋亡現象，凋亡因子的上調或下調最終引起海馬神經元細胞發生程序性死亡。Bax 和Bcl-2 分別為促凋亡基因和抗凋亡基因，因此該對基因的相對表達可誘導凋亡的發生，并參與癲癇的發病過程[19-20]。

本研究結果顯示，與空白對照組相比，癲癇模型組大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α 表達水平均顯著升高，IL-2 表達水平明顯降低，經過高壓氧治療干預后，與癲癇模型組相比，大鼠血清IL-1β、IL-8、TNF-α 表達水平顯著降低，IL-2 表達水平明顯升高，表明癲癇的發生發展與白介素家族基因表達水平具有一定相關性。與空白對照組相比，癲癇模型組促凋亡蛋白Bax 表達顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達顯著下降，經過高壓氧治療干預后，Bax 蛋白水平顯著下調而Bcl-2 蛋白水平顯著上調。因此，海馬神經元凋亡因子的表達調控癲癇疾病的發作過程。免疫熒光染色對海馬神經元凋亡因子Bax 和Bcl-2 的陽性神經元數量評估顯示，與空白對照組相比，癲癇模型組大鼠神經元Bax 陽性神經元數量顯著升高，而 Bcl-2 陽性神經元數量顯著降低，經過高壓氧治療干預后，Bax 陽性神經元數量明顯降低，而 Bcl-2 陽性神經元數量明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。因此，該結果也進一步證明了海馬神經元凋亡基因Bax 和Bcl-2 的相對變化與癲癇具有相關性。