雌二醇對小鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制

錢魯，李卓遠，張素勤

溫州醫科大學附屬第二醫院，浙江 溫州 325027，1.心內科；2.心電圖室

急性心肌梗死是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死。目前能夠改善急性心肌梗死患者預后的藥物均有一定降壓作用，對于心源性休克、血壓偏低的患者有一定應用限制。因此，如何改善急性心肌梗死患者的預后，仍是當今研究的熱點。急性心肌梗死的基本病理生理基礎是心肌缺血再灌注損傷及氧化應激。AMPK是細胞內應激應答的核心。MIF-AMPK信號通路是一條新發現的細胞信號通路[1-2]。缺血心臟釋放心肌巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor， MIF），MIF促進AMPK激活，促進下游葡萄糖的轉運[2]和抑制游離脂肪酸分解。ISO-1為選擇性MIF抑制劑， 能選擇性地結合MIF的互變異構酶活性位點，從而抑制MIF的一些生物學功能[3]。乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）是制約脂肪酸合成第一階段速度的限速酶。

人體內分泌的天然雌激素為雌二醇、雌酮及雌三醇。多項研究表明雌二醇與MIF的表達相關[4-6]，而雌二醇在心肌缺血再灌注損傷急性期中的保護機制目前尚無定論。本研究通過探討雌二醇在心肌缺血再灌注損傷中與MIF-AMPK信號通路的相互作用，為急性心肌梗死的治療提供新的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 一抗試劑包括MIF、AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC單克隆抗體均購自美國CST公司。雄性C57BL/6小鼠購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2017-0012。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組：按照隨機數字表法將6～8周齡的雄性C57BL/6小鼠分為6組，每組10只：①空白組：無任何試劑處理，無缺血再灌注；②對照組：無任何試劑處理，缺血再灌注；③雌二醇溶媒（中鏈甘油三酯）組（溶媒1）：在再灌注前30 min腹腔注射2 mg/mL中鏈甘油三酯（與雌二醇組等量）；④ISO-1溶媒組（溶媒2）：在再灌注前30 min腹腔注射DMSO（與雌二醇+ISO-1組等量）；⑤雌二醇組：在再灌注前30 min腹腔注射雌二醇1 mg/kg；⑥雌二醇+ISO-1組：在再灌注前30 min腹腔注射雌二醇1 mg/kg及ISO-1 10 mg/kg。

1.2.2 心肌缺血再灌注模型[2]：用異氟烷吸入麻醉后，小鼠氣管插管，用小鼠呼吸機進行機械通氣，用加熱板維持小鼠體溫37 ℃，開胸，在左心耳下方2 mm處用7-0尼龍線結扎前降支40 min（后期心臟B超檢查及TTC染色）或10 min（后期取心臟行Western blot實驗）后松開縫線再灌注，逐層關閉胸腔，移除小動物呼吸機，置于電熱毯保溫。

1.2.3 心臟功能檢測[2]：前降支結扎40 min后松開縫線再灌注48 h。通過經胸心臟超聲檢測左室射血分數（ejection fractions，EF）、左室短軸縮短率（fraction shortening，FS）。左室FS=（左心室舒張末期內徑-左心室收縮末期內徑）/左心室舒張末期內徑×100%。左室EF=（左室舒張末容積-左室收縮末容積）/左室舒張末容積×100%。通過TTC染色檢測梗死面積。心肌梗死面積百分率=梗死區（infarct size，INF）/缺血危險區（ratio of the area at risk，AAR）×100%。

1.2.4 心肌MIF蛋白、AMPK及ACC磷酸化程度檢測：前降支結扎10 min后松開縫線再灌注10 min，Western blot檢測心肌MIF蛋白、AMPK及ACC活化程度。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS19.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雌二醇保護缺血再灌注急性期心臟收縮功能，使用ISO-1后保護作用明顯減弱 雌二醇組小鼠EF較對照組明顯改善（P＜0.01），FS也有所改善（P＜0.01）。ISO-1拮抗MIF作用后雌二醇+ISO-1組的EF較雌二醇組有所下降（P＜0.01），FS也明顯下降（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 心臟超聲檢測各組小鼠左室EF和FS

2.2 雌二醇減少缺血再灌注急性期心肌梗死面積，應用ISO-1后梗死面積增大 雌二醇組心肌梗死面積較對照組明顯減低（P＜0.001），ISO-1抑制MIF作用后梗死面積較雌二醇組增加（P＜0.05），與對照組比差異無統計學意義（P=0.242）。見圖2。

圖2 雌二醇對缺血再灌注急性期心肌梗死面積的影響

2.3 雌二醇保護心肌梗死后心功能的機制 雌二醇組MIF相對表達量較對照組高（P＜0.001），雌二醇組p-AMPK及p-ACC相對表達量均較對照組高（P＜0.01），而IS0-1作用后p-AMPK及p-ACC相對表達量明顯減少（P＜0.05）。見圖3。

圖3 雌激素及ISO-1對MIF及其下游AMPK、ACC信號通路的作用

3 討論

流行病學調查發現冠心病的患者主要為中老年男性及絕經后女性。年輕女性冠心病的發病率遠小于相同年齡的男性，而這種差距在女性絕經期后迅速縮小。在絕經期后，女性中冠心病的發病率急劇上升[7-8]。多年來，女性這種對冠心病的“相對免疫”，被歸因為雌激素的保護作用。首先，雌二醇對血脂具有調控作用。雌二醇通過上調肝臟低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受體的表達、降低肝脂蛋白脂肪酶活性、減輕LDL的氧化修飾等途徑降低循環中LDL水平；雌二醇促進肝分泌膽汁酸，從而使膽固醇在肝臟的排出增多，降低體內膽固醇水平[9]。其次，雌二醇對血管內皮細胞具有調控作用。雌激素可以促進一氧化氮（NO）、前列環素（prostaglandin I2，PGI2）和內皮來源超極化因子（endothelium derived hyperpolarizing factor， EDHF）等血管舒張因子的產生，抑制內皮素-1 （endothelin-1，ET-1）的生成，減少內皮細胞活性氧的生成，從而改善血管內皮功能；并可以促進內皮的完整性，減少其對促動脈粥樣硬化因子的通透性；抑制血管內皮細胞表面黏附分子的表達，從而減少炎癥細胞的黏附和遷移；還可以抑制血管內皮細胞的凋亡并促進其增殖和生存[10-11]。也有研究報道雌二醇通過ET-1的作用，對受損心肌細胞和血管內皮細胞具有強大的修復作用，并促進心肌梗死后心功能的改善[12]。研究顯示小鼠心肌缺血再灌注后使用雌二醇對心臟表現出保護作用，其機制可能為增加線粒體Cx43的含量和磷酸化水平[13]、上調生物鐘基因Per2[14]、增強內皮祖細胞歸巢及血管生成能力[15]。另有研究表明，雌二醇通過抑制外周免疫細胞分泌MIF，從而抑制炎癥反應，促進皮膚外傷的愈合[6，16]。在子宮內膜異位癥患者中，血清雌二醇水平升高與子宮內膜MIF表達上調相關[4]，并且MIF的表達能夠被雌二醇受體拮抗劑氟維司群阻斷，被雌二醇選擇性激動劑上調[5]。但目前，雌二醇在心肌缺血再灌注急性期的作用與MIF-AMPK信號系統的關系未見相關研究。

在本研究中，雌二醇作用下缺血再灌注損傷后心肌梗死面積較對照組減小，心臟超聲檢查提示左室EF及FS較對照組升高，表明雌二醇處理對急性缺血再灌注損傷后心臟功能具有保護作用。

心肌缺血再灌注損傷及氧化應激是急性心肌梗死的核心病理生理過程。AMPK是細胞內應激應答的核心，它能夠調控能量代謝以促進ATP的合成。在心臟中缺血缺氧導致ATP耗竭、AMP累積，后者激活AMPK，從而恢復ATP的產生。AMPK信號通路能夠促進葡萄糖和脂肪酸的吸收、儲存和代謝。MIF是一種同源三聚體蛋白質，能夠在局部抑制巨噬細胞游走，促進炎癥反應的發生[17]。心肌細胞在缺血條件下MIF-AMPK信號通路受損，導致能量代謝能力的減弱，影響對缺血性損傷的耐受能力[18]，這是缺血再灌注損傷心功能的重要機制。AMPK下游的ACC磷酸化水平是心肌能量物質中游離脂肪酸代謝程度的重要指標。進一步的研究表明，在心肌梗死早期（6 h內），外周血MIF主要來自心肌細胞分泌，與心肌細胞膜上的CD74等MIF受體結合進入心肌細胞，通過MIF-AMPK信號系統，發揮調節底物代謝、抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用[19]。我們的前期研究發現，冠心病患者血清中MIF水平較對照組高，不穩定性心絞痛患者血清中MIF水平比穩定性心絞痛患者高[20]。

本研究結果顯示雌二醇作用后AMPK及ACC磷酸化水平增高。這表明雌二醇作用后游離脂肪酸氧化代謝受到抑制，梗死心肌能量代謝改善，推測這是雌二醇保護急性心肌梗死后心臟功能的一種可能的機制。而雌二醇作用下心肌組織MIF表達升高，其對AMPK-ACC信號通路的激活促進作用能被MIF抑制劑ISO-1拮抗，這表明雌二醇對AMPK及ACC的作用可能通過MIF實現，與MIF-AMPK信號通路相關。

綜上所述，雌二醇可能通過MIF-AMPK信號通路，改善心肌缺血再灌注急性期心肌代謝，增強心肌對缺血再灌注損傷的抵御能力。雌二醇作為人體本身存在的激素，短期使用無明顯降血壓作用，這對于急性心肌梗死患者可能具有良好耐受性，本研究結論可為雌二醇在心肌缺血再灌注急性期的應用提供依據。鑒于患者長期使用雌二醇存在血栓形成、卒中、乳腺癌、焦慮樣行為等風險[21]，因此，心肌梗死急性期雌二醇應用時限有待進一步研究。