查耳酮衍生物L2H24對H2O2誘導損傷的心肌細胞的保護作用

胡琳雅，洪承呂，陳潛，何文斐，吳建章

1.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 心血管內科，浙江 溫州 325015

研究表明，氧化應激是多種心血管疾病的重要病理機制，外界刺激誘使機體中產生過量的ROS，介導組織和細胞中脂質、DNA和蛋白質氧化損傷，進而導致強烈的炎癥反應和細胞死亡（焦亡、凋亡和壞死）[1-3]。而心臟作為高能量需求器官，極易受到氧化損傷[4]。

查耳酮類化合物是一類低毒的藥食同源的天然產物，具有抗氧化[5]、抗炎[6]、抗腫瘤[7]和抗真菌[8]等廣泛的生物活性。本課題組前期研究發現查耳酮衍生物L2H24能通過抗氧化和抗炎作用改善腦缺血再灌注損傷和急性肺損傷[9-10]，而L2H24能否在氧化應激相關的心肌細胞損傷中發揮保護作用及其分子機制尚未可知。本研究探討了L2H24對大鼠心肌細胞H9c2的保護作用，旨在闡明其對H2O2刺激所致細胞氧化應激和焦亡的影響及潛在的分子機制，以期為心肌氧化損傷的治療提供新的候選抗氧化劑。

1 材料和方法

1.1 材料 本研究所用化合物L2H24由本課題組的化學實驗室合成，結構見圖1[9]。大鼠心肌細胞H9c2購于中國科學院，DMEM（1 g/L）培養基、胎牛血清、0.25%含EDTA胰酶、PBS緩沖液、雙抗（10 000 U/mL） 購于美國Gibco公司，MTT噻唑藍購于北京索萊寶生物科技有限公司，結晶紫染色液、MDA檢測試劑盒、細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒購于上海碧云天生物技術公司，多聚甲醛、TBHQ（食品抗氧化劑）、30% H2O2購于上海阿拉丁試劑有限公司，一抗HO-1、Nrf2、IL-1β購自美國Santa公司，β-actin、GAPDH購于武漢三鷹生物技術有限公司，Caspase-1、抗兔、抗鼠二抗購于美國CST公司，Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司，小干擾RNA（si-Nrf2）序列購于上海吉瑪制藥技術有限公司，CO2恒溫培養箱購于美國Thermo公司，倒置熒光顯微鏡購于日本Nikon公司，酶標儀、ChemiDocTMXRS+凝膠成像儀器購于美國Bio-Rad公司。

圖1 L2H24的分子結構

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：H9c2細胞用DMEM（1 g/L）基礎培養基加10%的胎牛血清、1%的雙抗的完全培養基培養。約2～3 d消化傳代1次，傳代后約留30%的細胞用于繼續培養。

1.2.2 造模損傷H2O2濃度的確定：取處于對數生長期的H9c2細胞，3 000個/孔鋪96孔板，37 ℃恒溫培養箱中貼壁過夜。用終濃度為100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2孵育細胞24 h后，加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，4 h后吸走96孔板中的液體，重新加入DMSO 120 μL/孔，并置于微型振蕩器上混勻。待紫色晶體全部溶解，用酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處測定其吸光度（A）值，計算細胞生存率（實驗組A值/對照組A值×100%）。

1.2.3 MTT實驗：取處于對數生長期的H9c2細胞，3 000個/孔鋪96孔板，37 ℃恒溫培養箱中貼壁過夜（24 h），L2H24以不同濃度（0.3125、0.625、1.25、2.5、5 μmol/L）預孵育18 h后，加H2O2刺激，24 h后MTT法測細胞存活率。

1.2.4 集落克隆實驗：取處于對數生長期的H9c2細胞，2 000個/孔鋪12孔板，于37 ℃恒溫培養箱貼壁培養過夜（24 h），先加不同濃度的L2H24預孵育18 h，再加H2O2共同孵育。7 d后，棄去板內原有細胞培養基，用4%多聚甲醛室溫下固定細胞20 min， PBS緩沖液洗兩次，再用結晶紫染色30 min（可適當延長），用PBS清洗后晾干、拍照。

1.2.5 MDA含量測定：H9c2細胞20萬/孔鋪6孔板，置于37 ℃恒溫培養箱中貼壁培養過夜（24 h），先加5 μmol/L的L2H24、TBHQ各自預孵育18 h，再加H2O2刺激，2 h后收蛋白檢測MDA含量，實驗過程嚴格按照說明書進行。

1.2.6 細胞焦亡拍片：取處于對數生長期的H9c2細胞，2 000個/孔鋪96孔板，于37 ℃恒溫培養箱貼壁培養過夜（24 h），先加L2H24預孵育18 h，再加H2O2刺激，24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態改變。

1.2.7 Western blot檢測：H9c2細胞30萬/孔鋪6孔板，置于37 ℃恒溫培養箱中過夜培養（24 h），加不同濃度的藥物孵育18 h后收蛋白或者先加藥物預孵育18 h，再加H2O2刺激24 h后收蛋白。細胞總蛋白含量用考馬斯亮藍法測定，用SDS-PAGE分離蛋白樣品（80 μg），然后轉移到PVDF膜上。PVDF膜用5%的脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，后一抗4 ℃孵過夜（HO-1 1:500；β-actin 1:2 000；Caspase-1 1:1 000；IL-1β 1:1 000）。次日，用TBST室溫下在搖床上洗3次，后二抗孵60 min。蛋白條帶由ChemiDoc XRS+系統成像，ImageJ軟件定量。

1.2.8 細胞中核、漿Nrf2蛋白的檢測：細胞鋪板及加藥：大鼠心肌H9c2細胞30萬/孔鋪6孔板，37 ℃ 恒溫培養箱中貼壁過夜，加DMSO、L2H24孵育6 h后收蛋白。細胞核蛋白與細胞漿蛋白的提取：按漿蛋白提取試劑A:磷酸酶抑制劑為100:1的比例預先配制好蛋白裂解液并于冰上預冷，棄去6孔板中原有細胞培養基，加入PBS清洗干凈后，加入裂解液于冰上裂解10 min。用細胞刮刀刮下細胞蛋白并收集于1.5 mL的EP管中。將收完的蛋白在渦旋儀上渦旋 15 s，冰上靜置1 min。按說明書用量加入漿蛋白提取試劑B，渦旋5 s，冰上靜置1 min，重復兩次。以上蛋白樣品在高速離心機中以12 000×g離心 5 min。小心吸取上清液（即為漿蛋白），裝入新的EP管中備用。剩余沉淀，完全吸盡殘余的上清液，加入添加了磷酸酶抑制劑的細胞核蛋白抽提試劑，渦旋15 s，冰上靜置15 min，重復2次。之后，4 ℃ 12 000～16 000×g離心10 min。立即吸取上清液至一預冷的EP管中，即為抽提得到的細胞核蛋白，可以-70 ℃凍存備用。后以Western blot法檢測相關蛋白，一抗稀釋度：Nrf2 1:500，PCNA 1:1 000，GAPDH 1:2 000。

1.2.9 小干擾RNA沉默實驗：以Nrf2為靶點的si-RNA序列是由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并化學合成，nrf2-rat-1482的序列為sense（5’-3’）GGAGAGGGAAGAAUAAAGUTT，antisense（5’-3’）ACUUU AUUCUUCCCUCUCCTT。將大鼠心肌H9c2細胞以80萬/皿 鋪中皿，待細胞貼壁后加入按照說明書配制好的nrf2-rat-1482或Negtive Control序列（6 μL/mL，2 mL體系），用Lipofectamine 2000于饑餓培養基中轉染12 h，之后換為正常培養基，繼續培養12 h后收集細胞，進行后續實驗，剩余細胞繼續培養 48 h后收蛋白檢測Nrf2-si-RNA干擾效果。

1.3 統計學處理方法 使用SPSS22.0統計軟件進行分析。每個實驗重復3次以上，數據以表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H2O2損傷對H9c2心肌細胞存活率的影響 不同濃度的H2O2（100、200、300、400、500、600 μmol/L） 刺激H9c2細胞24 h后，細胞存活率隨著H2O2濃度的增加而不斷降低，呈現濃度依賴性。H2O2抑制細胞活力的IC50約為500 μmol/L。因此，后續實驗均選擇500 μmol/L濃度的H2O2構建心肌氧化損傷細胞模型。見圖2。

圖2 不同濃度H2O2刺激對H9c2細胞存活率的影響

2.2 H2O2介導H9c2細胞的氧化損傷 與對照組比，H2O2損傷降低了H9c2細胞在極低密度時的增殖能力，嚴重抑制了細胞的集落形成。MDA是由ROS引起的多不飽和脂肪酸過氧化的副產物，是氧化應激的重要生物標志物[11]。與對照組（100%）相比，H2O2處理2 h后，H2O2損傷模型組細胞中的MDA含量（234.0± 10.4）%明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。過量產生的ROS會促使細胞發生焦亡[12]。在H2O2損傷模型組中觀察到大量焦亡細胞腫脹膨大，并且有許多氣泡狀突出物。見圖3。

圖3 H2O2對H9c2心肌細胞氧化損傷和焦亡的影響

2.3 L2H24對H2O2誘導氧化損傷的H9c2細胞具有保護作用 與對照組比，H2O2組細胞存活率約為50%，用L2H24預孵育18 h后，氧化損傷的H9c2心肌細胞的存活率增加（P＜0.05），且隨著劑量的增加，存活率顯著升高，5 μmol/L濃度的L2H24對心肌細胞的保護作用明顯優于相同濃度的陽性對照藥TBHQ。集落克隆實驗結果表明，H2O2損傷抑制了心肌細胞的克隆形成能力，而L2H24預孵育18 h可逆轉上述情況。與對照組比，H2O2組細胞中的MDA含量明顯升高，而用L2H24預孵育18 h后，氧化損傷的心肌細胞中的MDA含量明顯降低（P＜0.05），且其降低MDA的能力明顯優于陽性對照藥TBHQ。見圖4。

圖4 L2H24對H2O2誘導的氧化損傷的H9c2細胞的保護作用

2.4 L2H24改善H2O2誘導的H9c2心肌細胞焦亡 L2H24預孵育18 h后，H2O2誘導的細胞焦亡現象得到改善。Western blot及其定量結果顯示，與對照組比，H2O2損傷組細胞中焦亡相關蛋白Caspase-1 p48、Caspase-1 p20、IL-1β的表達均增加（P＜ 0.05）。經L2H24處理后，細胞中Caspase-1 p48、Caspase-1 p20、IL-1β的表達降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 L2H24改善H2O2誘導的H9c2心肌細胞焦亡

2.5 L2H24促進Nrf2易位入核并增加其下游抗氧化蛋白HO-1的表達 氧化損傷相關蛋白檢測結果顯示，與對照組相比，L2H24給藥組細胞核中的Nrf2表達水平顯著上調，而胞漿中Nrf2蛋白表達水平則明顯降低（P＜0.05），即L2H24能促進Nrf2易位入核。進一步研究發現，L2H24能上調H9c2細胞中Nrf2下游抗氧化蛋白HO-1的表達水平。與DMSO組相比，L2H24以較低濃度（1.25 μmol/L）孵育細胞就能顯著上調細胞中的抗氧化蛋白HO-1的表達（P＜0.05），并且藥物濃度越高，HO-1蛋白表達水平隨之升高。見圖6。

圖6 L2H24促進H9c2細胞中Nrf2易位入核并增加其下游抗氧化蛋白HO-1的表達

2.6 干擾Nrf2的表達抑制了L2H24對H2O2誘導氧化受損心肌細胞的保護作用 運用Nrf2-si-RNA轉染細胞后，心肌細胞中Nrf2表達水平顯著下調（P＜0.05）。實驗結果顯示，L2H24可明顯提高對照si-RNA組（NC）中氧化受損細胞的存活率（P＜0.05），促進NC組中H2O2損傷細胞的集落形成，降低細胞中脂質過氧化水平（P＜0.05），改善心肌細胞焦亡，而在si-Nrf2組細胞中，L2H24并未顯現出相同的細胞保護活性。見圖7。

圖7 干擾Nrf2的表達抑制了L2H24對氧化受損心肌細胞的保護作用

3 討論

查耳酮類化合物廣泛分布于蔬菜、水果、茶葉和其他植物中[13]，近年來，因其具多樣的生物活性如抗菌、抗癌、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗潰瘍等而引起人們的廣泛關注[14]。報道顯示，查耳酮類化合物在高血壓、心律失常、心肌梗死和心力衰竭等多種心血管疾病的治療中發揮重要作用[15]。已有研究發現某些查耳酮類化合物可通過調節氧化應激水平來減輕心肌組織損傷，如天然抗氧化劑異甘草素能通過激活AMPK/ERK信號通路改善缺氧心肌細胞的收縮功能障礙[16]，還能通過抑制高血糖誘導的炎癥反應和氧化應激減輕糖尿病性心肌病[17]；玉郎傘查耳酮能通過激活JAK2/STAT3通路減輕大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷[18]；Aza白藜蘆醇-查耳酮衍生物6b通過減輕炎癥和氧化應激改善小鼠糖尿病性心肌病[19]。基于以上報道，本研究旨在探討查耳酮衍生物L2H24在氧化應激相關的心肌細胞損傷中的保護作用及其分子機制。

H2O2作為一種內源性細胞信號分子，可以在較短時間內誘導產生自由基，氧化DNA、蛋白質和核酸，最終導致細胞死亡，被廣泛應用于細胞氧化損傷模型中[20]。本研究采用H2O2刺激大鼠心肌H9c2細胞建立心肌氧化應激損傷模型來模擬體內氧化應激病理過程，發現500 μmol/L濃度的H2O2嚴重抑制了H9c2細胞的集落形成，顯著上調了細胞氧化損傷后產生的脂質過氧化物MDA的水平。查耳酮衍生物L2H24能夠呈劑量依賴性地增加H2O2損傷的H9c2細胞的存活率，促進細胞集落形成，同時顯著減少細胞中MDA的水平，對氧化損傷的心肌細胞具有良好的保護作用。

細胞焦亡是近年來發現并證實的一種新的程序性細胞死亡，又稱細胞炎性壞死，表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導致大量促炎因子釋放進而激活強烈的炎癥反應[21]。促炎Caspase亞家族中的Caspase-1可通過激活典型的炎癥小體途徑，介導焦亡的發生[22]。Caspase-1又被稱為IL-1β的加工酶，能介導產生成熟的IL-1β，這是一種重要的促炎細胞因子，參與多種人類疾病進程[23-24]。本研究發現，H2O2刺激能誘導心肌H9c2細胞產生氧化應激損傷，導致細胞腫脹膨大，并產生有許多氣泡狀突出物，發生嚴重的細胞焦亡現象，而查耳酮衍生物L2H24能夠明顯改善氧化損傷細胞的焦亡現象。進一步研究發現，L2H24能夠抑制H2O2誘導的Caspase-1/IL-1β活化。

核因子相關因子2，又稱NFE2L2或Nrf2，是調節抗氧化系統和細胞保護基因的關鍵分子[25-26]。Nrf2在肝臟、心臟、大腦、腎臟、血管和肌肉等多種耗氧器官中均有表達[27]。正常情況下Nrf2的表達僅限于細胞質，并以非活性形式存在。內源性抑制劑Keap1與Nrf2的相互作用促進了Nrf2的蛋白酶體降解[28]。然而，在氧化應激條件下，產生的ROS破壞了Keap1與Nrf2的相互作用，Nrf2被釋放入細胞核，并與ARE結合，激活其下游基因的轉錄，進而翻譯出一系列相關蛋白，發揮生理功能[29]，HO-1就是其下游一個重要的抗氧化蛋白[30]，故L2H24是否通過影響Nrf2/HO-1信號通路對H2O2誘導的H9c2細胞起保護作用值得被探討。本研究結果表明，L2H24能促進Nrf2易位入核并顯著上調H9c2細胞中其下游抗氧化的HO-1蛋白的表達水平。為了進一步確證化合物L2H24是否通過靶向Nrf2信號通路對H2O2誘導氧化損傷的心肌細胞起保護作用，我們運用小分子RNA技術干擾了H9c2細胞中Nrf2的表達，結果顯示，沉默Nrf2抑制了L2H24對H2O2氧化損傷細胞的保護作用，說明L2H24可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，從而對H2O2誘導氧化損傷的心肌H9c2細胞起到保護作用。

新近研究發現，氧化應激與細胞焦亡的發生息息相關，過量ROS可激活NLRP3炎癥小體并參與細胞焦亡途徑[12]，鐵激活的ROS通過ROS-Tom20-Caspase-3-GSDME信號通路誘導黑色素瘤細胞焦 亡[31]，線粒體ROS通過誘導GSDMD氧化促使巨噬細胞焦亡[32]。本研究發現，小分子RNA技術干擾Nrf2的表達抑制了L2H24對H2O2誘導心肌細胞焦亡的保護作用，側面證實了氧化應激與細胞焦亡的發生有關，這與文獻調研結果一致。研究結果表明，L2H24可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，從而對H2O2誘導的心肌H9c2細胞焦亡起到保護作用。

綜上所述，L2H24對H2O2誘導損傷的心肌細胞具有良好的保護作用，其可能是通過激活Nrf2/HO-1抗氧化信號通路來改善細胞氧化應激及焦亡。本研究初步證明了L2H24對H2O2誘導氧化損傷的心肌細胞的抗氧化和抗焦亡保護作用及其相關分子機制，為心肌氧化損傷的治療提供新的候選抗氧化劑。