rhFGF4在大腸桿菌中的表達、純化及其對高糖損傷的人臍靜脈內皮細胞的保護作用

張煜，吳芬芳，張夢，田海山，李校堃

溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035

近年來糖尿病已發展成為威脅人類健康的主要重大疾病[1-2]，而糖尿病性血管并發癥是該病最主要的致殘致死原因[3-5]，內皮功能障礙是其發病的主要機制之一。持續的高血糖狀況導致心血管內皮細胞代謝紊亂和氧化應激，從而引起滲透性增加、內皮舒張受損等，最終導致血管損傷[6]。因此，發現修復內皮細胞損傷的候選藥物，研究其促血管修復作用的機制對糖尿病性血管并發癥的治療具有重要意義，并可能會揭示其新的潛在治療靶點。

成纖維細胞生長因子4（fibroblast growth factor 4，FGF4）是由hst-1原癌基因編碼的一種生長因子[7-8]。研究表明，FGF4蛋白在體內外均具有顯著的促血管生成活性，并被證明在新生毛細血管的生長及在動脈生成過程中發揮關鍵作用[9]。據 此，我們在GenBank中查找到人FGF4（hFGF4）的編碼基因，通過密碼子優化在大腸桿菌中高效表達并純化，對高糖誘導損傷的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）模型的修復及相關作用機制開展研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及細胞：原核表達載體pET3d、大腸桿菌DH5α感受態細胞和大腸桿菌BL21（DE3）PlysS宿主菌均由本實驗室提供，原代HUVEC及NIH3T3細胞均由實驗室自備。

1.1.2 主要試劑：質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、限制性核酸內切酶NcoI和BamHI均購自英國BioLabs公司；Triton X-100購自北京索萊寶科技有限公司；氨芐霉素、氯霉素以及IPTG購自上海捷瑞生物工程有限公司；去氧膽酸鈉購自合肥Biosharp公司；DMEM低糖培養基和MCDB131培養基購自美國Gibco公司；ECM培養基購自美國ScienCell公司；PMSF、丙二醛（methylene dioxyamphetamine，MDA）檢測試劑盒以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；p-JNK、JNK、p-p65、p65、p-p38、p38、β-actin等抗體均購自美國CST公司；rhFGF2（bFGF）蛋白由本實驗室制備。

1.1.3 HUVEC的原代分離及培養：無菌條件下，將人臍帶放入含預熱PBS的培養皿中，剪去血腫部分并擠出臍帶血。將平針頭注射器從一端插入臍靜脈，止血鉗固定，預熱的PBS沖洗血跡至完全干凈。隨后用0.1%膠原酶II灌注使其充盈。取出針頭，止血鉗夾住注入端，移入培養皿中，在細胞培養箱孵育30 min后收集臍靜脈內的消化液。注入含10%胎牛血清的ECM培養液再次沖洗管腔，將消化液與沖洗液一并收集于離心管，1 000 r/min，5 min，棄上清液，加入ECM完全培養液，按1×106個/mL接種于培養瓶，使用ECM完全培養基于37 ℃，5% CO2培養。當長至80%左右，用含EDTA的胰酶消化傳代。給藥時使用含2% FBS和1%雙抗的MCDB131饑餓培養基。

1.1.4 NIH3T3細胞培養：將凍存的NIH3T3細胞復蘇后，使用DMEM低糖完全培養基培養于37 ℃，5% CO2培養箱中。長至80%左右，用含EDTA的胰酶消化傳代。給藥時使用含2% FBS和1%雙抗的DMEM低糖饑餓培養基。

1.2 方法

1.2.1 pET3d-hFGF4重組質粒的構建：由蘇州GENEWIZ公司優化并合成基因hFGF4（GenBank accession NO.NM_002007.3），將基因克隆至載體pUC57-Amp，含有NcoI和BamHI兩個酶切位點。用膠回收試劑盒提取由這兩種限制性核酸內切酶切割得到的目的片段和pET3d表達載體，通過DNA連接酶連接，得到pET3d-hFGF4重組質粒。將該質粒轉入DH5α感受態細胞中，通過雙酶切和基因測序進行驗證。

1.2.2 rhFGF4蛋白的表達：提取重組質粒轉入到大腸桿菌BL21（DE3）PlysS宿主菌中，用含有雙抗（100 μg/mL的氨芐青霉素和34 μg/mL的氯霉素）的LB瓊脂平板篩選。將陽性克隆接種到含有雙抗的LB液體培養基中，37 ℃，180 r/min震蕩培養至A600達到0.8～1.2，加入IPTG（終濃度0.5 mmol/L）誘導表達4 h，Western blot進行鑒別實驗。SDS-PAGE檢測篩選出高表達單菌落并將其制備成甘油菌，超低溫冰箱保存。取制備的甘油菌以1:100（V/V）接種到含有雙抗的LB液體培養基中進行種子擴增，以180 r/min、37 ℃振蕩培養至A600達到3.0～4.0。再將該菌液以1:20的比例接種于新鮮培養基中進行發 酵，以180 r/min、37 ℃振蕩培養至A600達到0.8～1.2，加入IPTG（終濃度0.5 mmol/L）誘導4 h，4 ℃，9 000 r/min離心10 min后收菌并凍存于-80 ℃。

1.2.3 rhFGF4菌體破碎：稱取菌體懸浮于40倍量（g/mL）裂解液（10 mmol/L PB，0.1 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，0.05% Tween-80，1 mmol/L PMSF，pH 7.4）中，充分攪勻，冰浴條件下超聲破碎，至鏡檢下可見視野范圍內無完整大腸桿菌。將破菌后的液體用高速冷凍離心機在4 ℃、20 000 r/min離心30 min。取上清液和沉淀，取樣進行12% SDSPAGE電泳，鑒定rhFGF4蛋白在大腸桿菌中的表達形式。

1.2.4 rhFGF4包涵體清洗及變性：可溶性分析結果示rhFGF4蛋白主要以包涵體形式表達，因此先進行多步包涵體洗滌操作去除膜蛋白、核酸及脂類等雜質，再進行變性溶解。取菌體破碎離心后的沉淀，加入40倍量（g/mL）洗滌緩沖液1（10 mmol/L PB，0.1 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，1% Triton X-100，0.2%去氧膽酸鈉，pH 7.4），充分混勻后室溫下磁力攪拌洗滌2 h，4 ℃、20 000 r/min離心30 min，棄上清液留沉淀；稱取沉淀，加入40倍量（g/mL）洗滌緩沖液2（10 mmol/L PB，0.1 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，1% Triton X-100，pH 7.4），充分混勻后室溫磁力攪拌洗滌2 h，4 ℃、 20 000 r/min離心30 min，棄上清液留沉淀。取沉淀，加入40倍量（g/mL）洗滌緩沖液3（10 mmol/L PB，0.1 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，1% Triton X-100，2 mol/L脲，pH 7.4），充分混勻后室溫磁力攪拌洗滌2 h，4 ℃、20 000 r/min離心30 min，棄上清液得包涵體。以上每一步取沉淀和上清液進行12% SDS-PAGE檢測。精密稱取包涵體，加入20倍量（g/mL）變性液（10 mmol/L PB，0.05 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，8 mol/L脲，10 mmol/L DTT，pH 7.4），充分混勻后在磁力攪拌條件下低溫溶解過夜（8～10 ℃，12 h以上），8 ℃、20 000 r/min離心30 min，取上清液得到包涵體變性溶液。

1.2.5 rhFGF4蛋白的純化：在蛋白純化設備（美國GE公司，AKTA pure）上，用10倍體積平衡液（10 mmol/L PB，0.05 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na， 8 mol/L脲，10 mmol/L DTT，pH 7.4）平衡肝素柱，流速1 mL/min；以0.5 mL/min上變性后的蛋白樣品，再用上述平衡液以流速0.5 mL/min充分平衡后開始進行梯度復性。A液：10 mmol/L PB，0.05 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，8 mol/L脲，10 mmol/L DTT，pH 7.4；B液：10 mmol/L PB，0.05 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA-2Na，10 mmol/L DTT，pH 7.4，梯度設置見表1。復性完全后，用含0.1、0.3、0.6、1.2、2.0 mol/L NaCl的洗脫液（10 mmol/L PB， 2 mmol/L EDTA-2Na，pH 7.4）進行洗脫（10個柱體 積，1 mL/min），收集各階段的穿出峰，用12% SDSPAGE檢測。

表1 柱上復性梯度設置

1.2.6 MTT實驗：計數實驗細胞，以4 000個/孔鋪于96孔板中。當細胞貼壁后，去除完全培養基，加入饑餓培養基培養6 h。為驗證rhFGF4蛋白的促增殖作用，加入不同濃度梯度的rhFGF4蛋白，并以bFGF蛋白作為陽性對照組、PBS作為陰性對照組。為驗證rhFGF4蛋白對高糖損傷的HUVEC有修復作用，加入葡萄糖溶液培養24 h后，加入不同濃度梯度的rhFGF4蛋白作用24 h，加入MTT避光培養4 h。去除培養基，每孔加入150 μL DMSO，測定490 nm處吸光度。

1.2.7 MDA的測定：將HUVEC細胞鋪于6孔板中，用葡萄糖溶液損傷24 h后，每孔加入不同濃度的rhFGF4蛋白，24 h后獲取總蛋白，用BCA試劑盒測定濃度，使用MDA檢測試劑盒測定其含量。

1.2.8 Western blot分析：提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定濃度，12% SDS-PAGE膠的上樣孔中每孔加入25 μg蛋白樣品，電泳結束后采用濕法轉膜系統轉膜1 h，5%脫脂牛奶中封閉1 h，TBST清洗3次，每次 6 min，4 ℃搖床上過夜孵育抗體：p-JNK（1:1 000），JNK（1:1 000），p-p65（1:1 000），p65（1:1 000），p-p38（1:1 000），p38（1:1 000），β-actin（1:5 000）。TBST清洗3次，每次6 min，在室溫下孵育羊抗兔或鼠IgG二抗（1:8 000）1 h，TBST清洗3次，每次 6 min，用Western blot Luminol檢測條帶，并用Image lab軟件進行定量。

1.2.9 流式細胞儀測定ROS含量：將HUVEC鋪于6孔板中，用35 mmol/L葡萄糖損傷24 h后，分別加入不同濃度梯度的rhFGF4蛋白，作用24 h，使用ROS檢測試劑盒處理細胞，流式細胞儀檢測ROS含量。

1.3 統計學處理方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計分析。所有實驗數據均以表示。使用單因素方差分析進行多組間比較，Tukey進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒的構建與鑒定 將構建于克隆載體pUC57上的hFGF4基因（542 bp）用NcoI和BamHI酶切并與pET3d表達載體（4 637 bp）連接，隨機挑選陽性菌株進行雙酶切鑒定。結果顯示，重組質粒酶切后表達載體與目的基因大小與理論值相符，表明成功構建pET3d-hFGF4重組質粒。見圖1。

圖1 pET3d-hFGF4重組質粒雙酶切鑒定

2.2 rhFGF4蛋白的表達與純化 選取不同單菌落培養誘導，通過SDS-PAGE檢測篩選出高表達菌株并將其制備成甘油菌。取甘油菌培養后誘導4 h，SDSPAGE結果見圖2A，Western blot鑒定結果呈陽性反應，見圖2B，表明制備的重組質粒穩定表達rhFGF4蛋白。常溫（37 ℃）誘導目的蛋白大部分以包涵體形式表達，低溫（20 ℃）誘導亦不能促進其可溶性表達量，表明在大腸桿菌表達系統中rhFGF4蛋白主要以包涵體形式表達，見圖2C和2D。將包涵體清洗后，用含8 mol/L脲的變性液溶解過夜，大部分目的蛋白可溶解于變性溶液中，見圖2E。將蛋白在變性條件下進行肝素親和柱層析，用A液平衡后與復性液B進行梯度復性。復性完全后，再利用目的蛋白、雜質與肝素的親和力不同，通過調節NaCl濃度進行洗脫，獲得純度＞95%的rhFGF4蛋白，見圖2F。

圖2 rhFGF4蛋白的表達與純化

2.3 rhFGF4蛋白促進NIH3T3細胞及HUVEC增殖 MTT法檢測rhFGF4蛋白對NIH3T3細胞和HUVEC的促增殖作用，以bFGF蛋白作為陽性對照。圖3A顯示，不同濃度下的rhFGF4蛋白均能促進NIH3T3細胞的增殖，并在0～320.0 ng/mL內呈劑量依賴性，表明純化的蛋白具有良好的生物學活性。圖3B顯示，rhFGF4蛋白能促進HUVEC的增殖，以濃度為80 ng/mL 及以上的促增殖作用最為顯著。

圖3 rhFGF4蛋白對NIH3T3細胞和HUVEC的促增殖活性

2.4 rhFGF4對高糖損傷的HUVEC具有修復作用 HUVEC鋪于6孔板中，用不同濃度葡萄糖溶液損傷24 h，MTT法測量吸光度值。結果顯示，葡萄糖溶液濃度為35 mmol/L時細胞死亡率約為50%，選擇該濃度建立HUVEC損傷模型，見圖4。HUVEC損傷24 h后，更換含有不同rhFGF4蛋白濃度的饑餓培養基作用24 h，并以bFGF蛋白作為陽性對照，MTT法測量吸光度值。結果顯示，rhFGF4蛋白對葡萄糖溶液損傷的HUVEC具有顯著的保護作用，并呈現劑量依賴性，見圖5。

圖4 不同濃度葡萄糖對HUVEC活力的影響

圖5 不同濃度rhFGF4蛋白對高糖損傷的HUVEC的促增殖作用

2.5 rhFGF4蛋白減少高糖損傷的HUVEC的MDA含量 高糖損傷HUVEC 24 h后，加入不同濃度rhFGF4蛋白作用24 h，收集蛋白測定MDA含量，結果顯示，與高糖損傷組（HG組）相比，不同濃度的rhFGF4蛋白均能顯著降低細胞內MDA含量，并呈現劑量依賴性，見圖6。

圖6 不同濃度rhFGF4蛋白對HUVEC中MDA含量的影響

2.6 rhFGF4蛋白減少高糖誘導的JNK、p38 MAPK以及NF-κB磷酸化的表達 結果顯示，高糖誘導增加p-JNK、p-p38以及p-NF-κB的磷酸化水平，而rhFGF4蛋白可以顯著抑制高糖誘導下的上述蛋白的過表達，見圖7。

圖7 rhFGF4蛋白對高糖誘導的JNK、NF-κB以及p38 MAPK磷酸化的影響

2.7 rhFGF4減少高糖損傷的HUVEC中ROS含量 流式細胞儀檢測結果顯示，高糖損傷HUVEC導致ROS含量增加（P＜0.05），見圖8A。高糖損傷24 h后，加入rhFGF4培養24 h，結果顯示，不同濃度的rhFGF4蛋白均能顯著降低細胞內ROS含量（P＜0.05），見圖8B。

圖8 rhFGF4對高糖損傷的HUVEC中ROS含量的影響

3 討論

血管內皮細胞是襯于血管內表面的單層扁平上皮細胞，是血液與組織之間的重要屏障[10]。糖尿病患者長期且持續的高血糖可降低血管內皮細胞DNA含量，影響血管內皮細胞的更新，進而加速內皮細胞的損傷，最終導致血管損傷，引發心腦血管、下肢血管等的病變[11]。因此，研究高糖條件下對血管損傷的保護和修復，具有重要的臨床意義。

已有文獻報道，FGF4蛋白作為重要的血管生長因子，通過MAPK途徑參與調控細胞分化[12]，并以自分泌的方式誘導VEGF分泌，間接促進血管內皮細胞的增殖和遷移，從而加速新生血管的形成[13]。由拜耳先靈制藥公司開發的Alferminogene tadenovec是一種可編碼人FGF4基因進而促進血管形成的基因治療藥物，主要用于心臟微血管缺陷導致的心肌缺血和慢性心絞痛患者[14-15]。但是，在高糖條件下FGF4蛋白是否仍對血管損傷具有保護和修復作用，目前尚未見相關研究報道。

為探討rhFGF4蛋白對血管的作用，本研究提取原代HUVEC作為檢測細胞株，陽性對照選擇FGFs中具有強促血管生成作用的bFGF蛋白[16-17]，結果表明，HUVEC活力下降是由高糖而非高滲引起，實驗組rhFGF4蛋白顯著促進HUVEC增殖，并在一定范圍內呈劑量依賴性，與bFGF蛋白促增殖作用相仿。建立高糖誘導損傷HUVEC模型，進一步探究rhFGF4蛋白對其保護作用，結果表明，rhFGF4蛋白顯著促進受損的HUVEC細胞增殖，并呈劑量依賴性，其中80 ng/mL 為最適宜濃度，其作用效果優于對照組bFGF蛋白。

研究表明，氧化應激是導致糖尿病性血管病變的重要機制[18]。本研究通過檢測高糖誘導損傷HUVEC模型檢測細胞中的ROS、MDA指標的變化，探討rhFGF4蛋白改善血管內皮細胞損傷的可能作用機制，結果顯示，與正常葡萄糖的環境相比，在高葡萄糖環境中HUVEC ROS、MDA含量顯著增加，而給予rhFGF4蛋白可以顯著降低高糖誘導產生的ROS、MDA含量。此外，p-38和JNK調節MAPK信號通路，參與氧化應激和細胞凋亡，氧自由基的形成會導致NF-κB的激活從而引起細胞凋亡[19-21]。通過檢測與氧化應激相關的信號轉導通路中的關鍵蛋白p-38、JNK以及NF-κB發現，rhFGF4蛋白在高糖損傷的HUVEC中可以抑制以上三個蛋白的磷酸化，從而保護HUVEC。實驗中原代HUVEC過于脆弱，在饑餓過程中會產生些許損傷，所以Western blot結果示意圖中，空白對照組的磷酸化程度也略有提高。

綜上，本研究提示rhFGF4蛋白可能通過改善氧化應激水平從而對高糖誘導的HUVEC起保護作用。后續需要進一步通過體內實驗證實，rhFGF4蛋白在高糖條件下對血管的保護和生成作用及機制，為臨床藥物的開發提供依據。