固相萃取-液相色譜-串聯質譜法測定海水中軟骨藻酸

王九明, 陳軍輝,2, 楊建勃, 何秀平,2*, 王愉寧, 王保棟,2

(1. 自然資源部第一海洋研究所, 自然資源部海洋生態環境科學與技術重點實驗室, 海洋生物資源與環境研究中心, 山東 青島 266061; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室,海洋生態與環境科學功能實驗室, 山東 青島 266071)

近幾十年來,隨著人類活動和全球氣候變化的加劇,近海赤潮災害發生頻率呈逐年上升趨勢[1]。目前已知全球約300多種海洋赤潮藻中,至少有100種是產毒藻,而有毒赤潮暴發后會釋放大量藻毒素,對海洋漁業生物造成嚴重危害,并且藻毒素易于通過食物鏈傳遞,進而威脅人類健康[2,3]。軟骨藻酸(domoic acid, DA)是一種具有神經毒性的典型海洋藻毒素,具有較強的親水性,是記憶喪失性貝毒的主要成分,主要由海洋硅藻擬菱形藻產生[4]。海洋環境中的DA不僅會毒害各類漁業生物,還會導致大型海洋哺乳動物及人類中毒,甚至死亡[5-8],例如DA曾引起美國大量海獅死亡[9],加拿大愛德華王子島貝類中毒事件,最終導致4人死亡[4]。此外,當海水中DA濃度達到3.2 pmol/L時,斑馬魚胚胎心臟畸形率增加;當海水中DA濃度達到32.0 pmol/L時,斑馬魚胚胎死亡率增加并且會改變心臟基因的表達[10]。

對我國近海海域的偽裝擬菱形藻(福氏擬菱形藻、尖細擬菱形藻、偽柔弱擬菱形藻和偽善擬菱形藻)進行分離純化,均檢測出了DA[11-13],由此可以看出,在我國海域中,能產生DA的有毒藻較多。近海海域又是海產養殖區密集分布地,海水中的DA將威脅海產養殖業的健康發展。因此針對近海養殖區海水中的DA進行有效監測尤為重要。

目前,用于海產品中DA檢測的常用方法主要包括:高效液相色譜法[14]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[15]、酶聯免疫分析法等[16]。其中,LC-MS/MS具有特異性強、準確度和靈敏度高等優點,是目前DA測定最常用的方法。近海海水中DA含量通常在ng/L水平[17,18],且高鹽海水基質樣品無法直接進行LC-MS/MS檢測,因此需要對海水樣品中的DA進行富集和凈化。被動固相吸附法和固相萃取法(包括小柱和膜盤)是目前海水中DA富集的常用方法[3],被動固相吸附法已用于美國加利福尼亞沿岸海水中DA的富集檢測[19],但該方法不能確定對海水中DA的富集倍數,致使無法對海水中DA進行準確定量。Wang等[20]采用反相C18固相萃取柱實現了20.0 mL海水中DA的富集,但通過增加海水上樣量提高DA富集倍數時,DA回收率會明顯下降。王九明等[18]利用固相萃取膜盤實現了海水中痕量DA的高效富集,富集倍數高達2 000倍,然而該方法需要消耗大量海水樣品(2.0 L),并且整個處理過程有機溶劑消耗量大,操作過程復雜。

近十年來,在線固相萃取技術在水環境有機污染物快速檢測領域應用越來越廣,實現了微囊藻毒素[21]、除草劑[22]、多環芳烴[23]以及脂溶性海洋藻毒素[24]等有機污染物的快速檢測。該技術具有所需水樣少、有機溶劑用量少、自動化程度高、快速高效等優點,在水環境有機污染物日常檢測和監測工作中具有廣闊的應用前景[25,26]。迄今為止,采用在線固相萃取結合液相色譜-質譜聯用技術快速富集檢測海水中DA的研究鮮有報道,本文通過兩種前處理模式,建立了檢測海水中DA的分析方法,海水樣品經酸化處理后,直接進行在線SPE-LC-MS/MS測定,適用于DA含量相對較高的海水樣品測定;針對DA濃度較低的海水樣品,先采用離線SPE富集、凈化,然后結合在線SPE-LC-MS/MS對樣品進行進一步處理和分析,以實現海水中超痕量DA的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1 290 II超高效液相色譜儀(配有四元泵、二元泵、自動進樣器(帶大體積進樣組件,最大進樣量為900 μL)、柱溫箱(帶兩位六通閥))、6470A三重四極桿質譜儀(配有噴射流電噴霧電離(ESI)源)、5 TC-C18(2)保護柱(12.5 mm×4.6 mm, 5 μm)和5 TC-C18(2)分析柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)(美國Agilent公司); Fotector Plus全自動固相萃取儀(睿科集團(廈門)股份有限公司); FA1104電子天平(上海精天電子儀器廠); Milli-Q超純水處理系統(美國Millipore公司); RE100-Pro旋轉蒸發儀(北京大龍公司); HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL,納譜分析技術(蘇州)有限公司); 0.22 μm混合纖維微孔濾膜(上海新亞凈化器件廠)。

色譜純甲酸和優級純乙酸銨(瑞士Fluka公司);色譜純甲醇和乙腈(美國Tedia公司); DA標準品(美國Sigma公司);實驗用水為自制Milli-Q超純水(18.2 MΩ·cm)。海水樣品取自青島近海。

1.2 標準溶液的配制

取1.0 mg DA標準品,用5%乙腈水溶液溶解,并定容至10.0 mL容量瓶中,得到質量濃度為100.0 mg/L的DA標準儲備液,于-80 ℃避光保存。用5%乙腈水溶液對DA標準儲備液逐級稀釋,得到質量濃度為1.0 ng/L～1.0 mg/L的系列標準溶液,于-20 ℃避光保存。

1.3 實驗條件

1.3.1離線固相萃取條件

移取經0.22 μm濾膜過濾的80.0 mL海水樣品,加入0.32 mL甲酸進行酸化,以1.0 mL/min的流速通過HLB固相萃取柱(已用5.0 mL甲醇和超純水活化,加載流速為1.0 mL/min),并使用5.0 mL超純水進行淋洗,淋洗后利用氮氣以160 mL/min的流速氣推持續5 min;再采用10.0 mL甲醇洗脫DA,洗脫流速為1.0 mL/min;將甲醇洗脫液于50 ℃條件下旋蒸至近干,用0.8 mL 5%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)復溶,并用0.22 μm濾膜過濾,待測。

圖 1 在線固相萃取時六通閥切換示意圖Fig. 1 Switch schematic diagrams of the six-way valve for on-line SPE systema. sample loading step; b. elution and analysis step.

1.3.2在線固相萃取條件

海水樣品經酸化(加入海水體積0.1%的甲酸)或經離線固相萃取后,均可直接進行在線SPE-LC-MS/MS分析。使用5 TC-C18(2)保護柱(12.5 mm×4.6 mm, 5 μm)作為在線SPE柱進行DA在線富集,進樣體積為0.6 mL,樣品加載流動相為5%乙腈水溶液(含0.1%甲酸),流速為1.0 mL/min。在線固相萃取六通閥切換示意圖如圖1所示,0～8 min時,六通閥為1-6位相通(見圖1a); 8～20 min時六通閥切換至1-2位相通(見圖1b); 20 min后六通閥切回1-6位相通。

1.3.3液相色譜-串聯質譜條件

色譜柱5 TC-C18 (2)分析柱(150 mm×4.6 mm, 5.0 μm),柱溫25 ℃,流動相(A)水和(B)90%乙腈水溶液(均含2.0 mmol/L乙酸銨和0.2%甲酸),流速0.5 mL/min。梯度洗脫程序:0～8 min, 3%B; 8～18 min, 3%B～100%B; 18～20 min, 100%B。

離子源:ESI源、正離子模式,毛細管電壓:4 000 kV;鞘氣流速:11 L/min;鞘氣溫度:340 ℃;干燥氣流速:7 L/min;干燥氣溫度:300 ℃;霧化器壓力:310.6 kPa;多反應監測(MRM)模式;DA母離子m/z為312.1,碎裂電壓130 V;子離子m/z分別為248.2(定性)和266.2(定量),碰撞能量分別為18 eV和16 eV。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

根據前期[18]研究結果,5 TC-C18(2)色譜柱對DA有良好的分離效果,因此本文采用5 TC-C18(2)分析柱用于DA的色譜分離。

甲醇水溶液[27]和乙腈水溶液[28]常被用作DA液相色譜分離的有機流動相,于是對90%甲醇水溶液(含2.0 mmol/L乙酸銨和0.2%甲酸)和90%乙腈水溶液(含2.0 mmol/L乙酸銨和0.2%甲酸)作為有機流動相時DA的LC-MS/MS分析結果進行了比較。如圖2a所示,90%甲醇水溶液對DA有更強的洗脫能力,但目標物響應相對較低;90%乙腈水溶液作為有機流動相時,DA響應更高,具有更好的儀器檢測靈敏度。由于DA在質譜中易生成[M+H]+母離子,流動相中酸性程度影響化合物離子化效率,進而影響方法的靈敏度。本文對流動相中添加不同體積分數甲酸(0.1%、0.2%、0.3%和0.4%)的效果進行了比較(見圖2b),可以看出,甲酸體積分數為0.2%時,DA的響應最高。因此選擇90%乙腈水溶液(含2.0 mmol/L乙酸銨和0.2%甲酸)為有機流動相。

圖 2 (a)不同有機流動相體系時DA的色譜圖和(b)流動相中添加不同體積分數甲酸時DA的峰面積(n=3)Fig. 2 (a) Chromatograms of domoic acid (DA) with different organic mobile phases and (b) peak areas of DA with different volume fractions of formic acid in the mobile phase (n=3) Mobile phase in Fig. 2a: (1) 90% methanol aqueous solution (including 2.0 mmol/L ammonium acetate and 0.2% formic acid); (2) 90% acetonitrile aqueous solution (including 2.0 mmol/L ammonium acetate and 0.2% formic acid).

2.2 質譜條件的優化

采用ESI源分析DA,在正離子模式條件下DA易生成m/z312.2 [M+H]+特征離子峰,負離子模式下易生成m/z310.2 [M-H]-特征離子峰。但正離子模式條件下DA的檢測靈敏度更高,因此選擇在正離子模式下進行海水樣品中DA的分析。

隨后,在MRM模式下,對影響母離子(m/z312.2)和子離子豐度的兩個主要參數破碎電壓和碰撞能量進行了優化。破碎電壓為130 V時,方法靈敏度最高;通過調節碰撞能量,選取DA二級質譜分析的最優子離子,以信號最強的子離子(m/z266.2)為定量離子,信號次強的子離子為定性離子(m/z248.2),并通過優化各離子對的碰撞能量,最終確定最優碰撞能量為16 eV(m/z266.2)和18 eVm/z248.2)。

2.3 離線固相萃取條件的優化

在離線固相萃取時,選擇能高效富集DA的固相萃取柱至關重要。HLB固相萃取柱填料為聚乙烯吡咯烷酮聚合物,對極性和非極性化合物均有較好的富集效果,因此選擇HLB固相萃取柱用于海水中DA的離線富集凈化。因DA屬于弱酸性化合物,在海水中易發生電離,不易于HLB固相萃取柱對其吸附,因此,可通過酸化海水樣品抑制其電離,提高HLB小柱對DA的富集效率。海水加標樣品(10.0 ng/L)添加不同體積的甲酸,海水酸化處理后DA的回收率明顯提高,當甲酸的體積為0.32 mL時,HLB固相萃取柱對DA的吸附效率最高(見圖3)。這與王九明等[19]采用磺化苯乙烯-乙烯基苯共聚物(SDB-RPS)固相萃取膜盤富集海水中的DA所添加的甲酸體積相一致。

圖 3 不同甲酸體積對海水中DA回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of different formic acid volumes on the recoveries of DA in seawater (n=3)

2.4 在線固相萃取條件的優化

采用在線固相萃取用于水樣中有機化合物的富集時,首先是選擇填料類型合適、富集凈化效果良好的富集柱。據相關文獻[20]可知,反相C18填料的固相萃取柱可以富集海水中的DA,基于此,實驗對4種不同填料的在線固相萃取柱進行了比較(見圖4), 4種富集柱分別為美國Agilent公司的5 TC-C18(2)(12.5 mm×4.6 mm, 5 μm)、Zorbax Eclipse Plus-C18(12.5 mm×2.1 mm, 5 μm)、Zorbax Eclipse XDB-C8(12.5 mm×2.1 mm, 5 μm)和PLRP-S(12.5 mm×2.1 mm, 15～20 μm)柱。5 TC-C18(2)柱對DA有更好的保留能力,峰形較好并且質譜響應較高;DA在Zorbax Eclipse Plus-C18在線固相萃取柱上峰寬較窄,但質譜響應較低;DA在Zorbax Eclipse XDB-C8和PLRP-S在線固相萃取柱上會產生擴散現象,導致峰寬較寬。因此,實驗選擇5 TC-C18(2)柱作為測定DA的在線固相萃取柱。

圖 4 不同在線固相萃取柱對DA保留能力的影響Fig. 4 Effect of different on-line SPE columns on the DA retention abilities

實驗還考察了海水樣品酸化處理對5 TC-C18(2)柱在線富集DA的影響,加入相對海水體積0.1%的甲酸時,DA的富集率最高、色譜峰面積最大,因此最終確定了加入甲酸的體積為海水體積的0.1%。

2.5 方法學考察

本文對兩種檢測模式下方法的基質效應(ME)、線性范圍、靈敏度和回收率等進行了考察。

2.5.1基質效應評價

ME在LC-MS/MS分析中普遍存在,主要表現為對目標化合物的檢測信號有增強或者抑制作用,從而影響目標化合物的定量準確度。ME=|基質溶液中DA的峰面積-純水溶液中DA的峰面積|/純水溶液中DA的峰面積。ME可分為3個等級:(a)0～20%,輕微影響;(b)20%～50%,中度影響;(c)大于50%，顯著影響[29]。

本文分別采用超純水和空白海水配制3個水平(20.0、80.0和300.0 ng/L)的DA加標樣品,每個水平制備3個平行樣品,通過在線SPE-LC-MS/MS和離線SPE結合在線SPE-LC-MS/MS測定比較,考察ME對檢測結果的影響。在這兩種檢測模式下,平均ME分別為18.3%(低、中和高水平基質效應:19.7%、18.5%和16.7%)和13.7%(低、中和高水平基質效應:15.1%、14.2%和11.8%), DA質譜信號均受到輕微影響,因此在采用在線SPE-LC-MS/MS和離線SPE結合在線SPE-LC-MS/MS測定海水DA過程中可以忽略ME的影響。

2.5.2線性方程

將DA標準儲備液逐級稀釋,得到質量濃度分別為0.3、1.0、3.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0和500.0 ng/L的系列標準溶液,以DA的質量濃度(ng/L)為橫坐標(x, ng/L)、定量離子峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線。在10.0～500.0 ng/L范圍內,直接在線SPE-LC-MS/MS檢測模式下的線性方程為y=7.431 1x+188.68(線性相關系數R2=0.999 2);在0.3～50.0 ng/L范圍內,離線SPE結合在線SPE-LC-MS/MS檢測模式下的線性方程為y=524.07x+163.87(R2=0.999 0)。結果表明這兩種檢測模式下線性范圍內線性關系良好。

2.5.3檢出限和定量限

在空白海水樣品中加入低水平的DA標準溶液,分別采用兩種檢測模式考察方法的靈敏度,將DA信噪比(S/N)為3和10時所對應的質量濃度作為方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。海水樣品直接采用在線SPE-LC-MS/MS測定,LOD和LOQ分別為4.0 ng/L和10.0 ng/L,已達到或優于表1所列文獻中方法的靈敏度,能滿足近海海水中DA的常規監測需求。離線SPE結合在線SPE-LC-MS/MS測定,方法LOD和LOQ分別為0.1 ng/L和0.3 ng/L,明顯優于其他文獻[18,30,31],可用于遠岸海水中超痕量DA的測定以及開展海水中DA降解規律等對檢測靈敏度要求較高的研究工作。

表 1 本方法與文獻方法的比較

2.5.4回收率和精密度

取空白海水樣品,采用標準加入法對方法的回收率和精密度進行考察。結果表明,直接采用在線SPE-LC-MS/MS測定低、中、高水平(20.0、100.0和300.0 ng/L)DA海水加標樣品,每個加標水平制備6個平行樣(n=6), DA的平均加標回收率分別為81.0%、83.5%和86.6%, RSD分別為4.2%、4.1%和3.8%,表明在該檢測模式下方法回收率和精密度均良好。離線SPE結合在線SPE-LC-MS/MS測定模式下,方法的加標回收率在低、中、高(1.0、5.0和20.0 ng/L)水平下分別為69.2%、71.7%和78.5%, RSD分別為4.4%、4.3%和3.1%,說明兩步固相萃取可滿足海水中的DA有效富集,并且方法的精密度良好,滿足實際海水中DA測定的準確度要求。

3 結論

本文建立了在線SPE-LC-MS/MS和離線SPE結合在線SPE-LC-MS/MS測定海水中DA的分析方法。海水樣品經酸化處理后可直接進樣分析,該方法操作簡單,自動化程度高,節省溶劑,較小體積海水樣品即可滿足近海海水中DA常規監測的靈敏度要求。海水樣品經離線SPE結合在線SPE-LC-MS/MS大體積進樣分析,具有更低的靈敏度,可為大洋或極地海水中超痕量的DA測定提供可靠的技術支撐。另外,所發展的技術方法還可推進海水中DA檢測方法相關標準的建立,為海水環境中限量標準的制定和毒理研究提供依據。