固相萃取-原子熒光光譜法測定大米中無機硒的含量

張 穎,黃文耀,唐 琳,孔 芳,華俊輝

(湖北省疾病預防控制中心,應用毒理湖北省重點實驗室,武漢 430079)

硒是機體必需的微量元素,但適宜劑量范圍很窄,其生物效應和毒性與硒的形態密切相關[1-4]。在硒的各種形態中,無機硒的毒性較大,吸收和利用不理想,過量會對人體造成傷害[5-7]。無機硒的存在形態主要為可溶于水的硒酸根和亞硒酸根,有機硒的存在形態主要為硒蛋白和硒代氨基酸,普遍認為,谷物中硒主要以硒代蛋氨酸形式(包括游離的和結合蛋白的)存在[8-10],其中部分小分子硒代氨基酸也溶于水,因此測定無機硒的含量時需要排除水溶性有機硒的干擾。

目前硒形態的測定方法主要為原子熒光光譜法和儀器聯用法(包括高效液相色譜-原子熒光聯用法[11-12]和高效液相色譜-電感耦合等離子體聯用法[13-16])。儀器聯用法可測得硒的各種形態的含量,但儀器價格昂貴,對操作技術要求較高,不適宜普遍推廣應用。原子熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強、穩定性好、成本低廉、通用性強等優點,但需要一種有效的無機硒的提取分離方式。現有的文獻報道中,多采用較高濃度的鹽酸溶液直接提取無機硒[17-20]或水溶液提取后用有機溶劑萃取有機硒而得到無機硒的提取方式[21-23],上述方式均可能造成有機硒的轉化或不能完全分離有機硒,使無機硒的測定結果偏高。本工作采用固相萃取的前處理方式,特異性吸附硒酸根和亞硒酸根,去除大米中有機硒和樣品基底的干擾,以達到分離富集無機硒的目的,再采用原子熒光光譜法測定無機硒的含量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

AFS-9700型雙道原子熒光光度計;DB-2EFS型智能石墨電熱板;DTC-33 型超聲波清洗器;Z383K 型低溫高速離心機;THZ-82型恒溫振蕩器;Milli-Q Advantage A10 型超純水儀;SAX 強陰離子交換柱(1 000 mg/6 mL)。

硒標準儲備溶液:1 000 mg·L-1。

硒標準溶液:1 mg·L-1,移取適量硒標準儲備溶液,用5%(體積分數,下同)鹽酸溶液稀釋。

硒標準溶液系列:分別移取1 mg·L-1的硒標準溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL,加入100 g·L-1鐵氰化鉀溶液10 mL,用5%鹽酸溶液定容至100 mL,配制成0,2.00,4.00,6.00,8.00,10.0μg·L-1的硒標準溶液系列。

富硒大米樣品購自湖北省恩施地區,標注有“富硒”字樣;普通大米樣品購自武漢某超市。

硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸的純度均為98%;硝酸、鹽酸、高氯酸、氫氧化鈉、硼氫化鉀均為優級純;鐵氰化鉀為分析純;試驗用水由Milli-Q Advantage A10型超純水儀制得(電阻率大于18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

光電倍增管負高壓300 V;硒空心陰極燈,燈電流80 m A;爐高8 mm;載氣為氬氣,流量400 mL·min-1;屏蔽氣為氬氣,流量1 000 mL·min-1;延遲時間1 s;讀數方式峰面積,讀數時間15 s;進樣體積2 mL。

1.3 試驗方法

稱取經烘干粉粹過篩的大米粉0.5 g,置于50 mL塑料離心管中,加入20 mL 水,超聲10 min后,于90 ℃水浴振蕩提取60 min,其間每隔10 min取出,上下顛倒,使樣品充分混勻,水浴結束后,再超聲提取20 min[10,19]。冷卻,以轉速8 000 r·min-1離心15 min,取上層清液,用5 g·L-1氫氧化鈉溶液調至pH 4～7,過濾,移取濾液10 mL 作為提取液。SAX 強陰離子交換柱經3 mol·L-1鹽酸溶液10 mL 活化、水20 mL 平衡。將提取液移入交換柱,流出速率小于3 mL·min-1,再用3 mol·L-1鹽酸溶液10 mL洗脫吸附在柱上的無機硒(洗脫速率1 mL·min-1),收集洗脫液。將洗脫液轉移至錐形瓶,按GB 5009.93-2017《食品安全國家標準食品中硒的測定》[24]第一法中前處理方法進行濕法消解,再采用第一法氫化物原子熒光光譜法測定樣品中總硒含量,按1.2節儀器工作條件測定樣品中無機硒的含量。

2 結果與討論

2.1 提取劑的選擇

硒形態的提取方式通常有水提取法、酸提取法、堿提取法和酶提取法[10-11],酶提取法將硒蛋白酶解為硒代氨基酸[25],主要目標化合物為硒蛋白。無機硒的提取劑通常為水、酸或堿試劑,本試驗在前期研究工作的基礎上[10,25],采用水提取大米中的無機硒。

2.2 提取液酸度的選擇

固相萃取柱選用SAX 強陰離子交換柱,需經3 mol·L-1鹽酸溶液10 mL 活化、水20 mL 平衡。試驗考察了提取液的不同酸度(pH 3～10)對無機硒(硒酸根和亞硒酸根)加標水溶液和有機硒(小分子硒代氨基酸,包括硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸)在SAX強陰離子交換柱上的保留情況,按試驗方法測定相應的洗脫液中硒含量并計算回收率,結果見圖1。

圖1 提取液的不同酸度對固相萃取柱吸附無機硒和硒代氨基酸的影響Fig.1 Effect of different acidity of extract solution on adsorption of inorganic selenium and selenium amino acids by solid phase extraction column

由圖1可知:當提取液的pH 為4～10時,無機硒的回收率基本保持不變;當pH 大于7時,硒代氨基酸的回收率逐漸增大。表明pH 為4～7時,無機硒的分離效果較好。為排除硒代氨基酸的影響,試驗選擇提取液的pH 為4～7。

2.3 洗脫液體積的選擇

試驗分別收集10,20,30,40,50 mL 的洗脫液,按試驗方法測定硒含量并計算回收率。結果表明:不同體積洗脫液的回收率分別為93.7%,94.1%,94.1%,94.0%,93.9%,說明洗脫液體 積 為10 mL時即可獲得良好的回收率,無需進一步增大洗脫液體積。

2.4 標準曲線與檢出限

按儀器工作條件對0,2.00,4.00,6.00,8.00,10.0μg·L-1的硒標準溶液系列進行測定,以硒的質量濃度為橫坐標,其對應的熒光強度為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示:標準曲線在10.0μg·L-1以內呈線性關系,線性回歸方程為y＝138.9x＋90.07,相關系數為0.999 9。

按試驗方法連續測定空白樣品11次,測定結果的標準偏差(s)為0.021μg·L-1,以樣品稱樣量為0.5 g,定容體積為10 mL 計,換算為0.84μg·kg-1。以3倍標準偏差計算方法的檢出限(3s),所得結果為2.52μg·kg-1,以10倍標準偏差計算方法的測定下限(10s),所得結果為8.40μg·kg-1。

2.5 精密度和回收試驗

取普通大米(無機硒含量較低)樣品,按1.3節試驗方法測定其總硒和無機硒的含量。然后根據國家標準GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》附錄F[26]的規定,在上述樣品中加入3個濃度水平的硒標準溶液,將大米粉充分振蕩混勻,放置24 h后,按試驗方法測定,每個樣品平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表1。

由表1 可知:無機硒的回收率為90.3%～98.2%,測定值的RSD 為9.9%～19%,符合國家標準GB/T 27404-2008[26]規定的不同水平的實驗室精密度要求。

表1 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.6 樣品分析

按照1.3節試驗方法測定富硒大米和普通大米樣品中的總硒和無機硒含量,有機硒含量采用總硒含量與無機硒含量的差值計算可得,并計算無機硒和有機硒分別在總硒中的占比,結果見表2。

表2 樣品分析結果Tab.2 Analytical results of samples

由表2可知:大米樣品中無機硒占比為1.3%～9.7%,說明在沒有人工非法添加無機硒的情況下,天然大米中無機硒的含量較低,主要存在形式為有機硒。

本工作采用固相萃取的前處理方式,在弱酸性范圍內,采用SAX 強陰離子交換柱吸附硒酸根和亞硒酸根,去除有機硒小分子和樣品基體的干擾,避免前處理過程中因有機硒小分子轉化而造成的無機硒測定結果偏高。為防止固相萃取柱的過載,建議選用容量較大的固相萃取柱。該方法的檢出限為2.52μg·kg-1,與GB 5009.93-2017 第一法氫化物原子熒光光譜法測定食品中的總硒的方法檢出限(2μg·kg-1)相當[24],靈敏度高,不僅可以測定富硒大米中的無機硒,對普通大米中無機硒的測定同樣適用,方法的適用范圍廣。