高效液相色譜法測定食用油中抗氧化劑的國家標準方法的優化研究

鐘慈平,成長玉,蘇 欣,周海燕,馬 偉,余曉琴?

(1.四川省食品檢驗研究院,成都 611731;2.四川農業大學 食品學院,雅安 625014)

油脂受氧氣、光、熱、微生物等影響會逐漸水解或氧化而變質酸敗,進而分解為甘油和油脂酸,然后油脂酸中不飽和鏈斷開形成過氧化物,再依次分解為低級油脂酸、醛類、酮類等物質[1-2],從而產生異味、改變感官性質、破壞營養物質,甚至可能致癌[3]。抗氧化劑可分為天然抗氧化劑(維生素E、茶多酚等)和合成抗氧化劑[4-5],其作為食品添加劑,能防止油脂自動氧化并有效增加脂類物質的氧化穩定性。因合成抗氧化劑更易制得、價格低廉、抗氧化能力更強而被廣泛使用,同時為了達到更好的抗氧化效果,生產者會在食品中添加多種抗氧化劑復配使用[6]。動物試驗證明,使用過量抗氧化劑會誘發癌癥等疾病,對人體有較大潛在的危害[7-9]。我國食品添加劑標準GB 2760-2014 規定叔丁基對苯二酚(TBHQ)、叔丁基對羥基茴香醚(BHA)和2,6-二叔丁基對甲基苯酚(BHT)在油脂中的殘留量不超過0.2 g·kg-1,沒食子酸丙酯(PG)在油脂中的殘留量不超過0.1 g·kg-1[10]。食用油是油脂的大眾消費主體,因此很有必要建立一套準確、快速、穩定測定食用油中抗氧化劑含量的方法。

目前,檢測抗氧化劑的方法較多,包括氣相色譜法[11]、氣相色譜-串聯質譜法[12]、高效液相色譜法[13-14]、高效液相色譜-串聯質譜法[15]、電化學法[16]和比色法[17]等。比色法靈敏度低、準確度差,不能同時測定多種抗氧化劑;電化學法靈敏度較高,但選擇性差,電解液毒性較大,對環境污染大。國家標準GB 5009.32-2016《食品安全國家標準 食品中9種抗氧化劑的測定》[18]自2017年實施以來,檢測機構在使用過程中發現,此標準第一法(高效液相色譜法)回收率普遍偏低,部分樣品存在明顯的干擾(具體見2.1 節)。針對上述問題,本工作對GB 5009.32-2016第一法主要做了以下優化:①以含L-抗壞血酸棕櫚酸酯(AP)的正己烷飽和的乙腈溶液(配制方法見1.1節)作為提取劑,AP能降低抗氧化劑在提取和凈化濃縮過程中的損失;②增加提取劑用量;③合并收集凈化步驟過程中的淋洗液和洗脫液,大大提高回收率;④篩選合適色譜柱和優化流動相,改善分離度。

通過以上改進,食用油中2,4,5-三羥基苯丁酮(THBP)、去甲二氫愈創木酸(NDGA)、PG、TBHQ、沒食子酸十二酯(DG)、沒食子酸辛酯(OG)、2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(Ionox-100)、BHA 和BHT 等常見的9種抗氧化劑回收率提高至62.0%～104%,分離度滿足要求,其結果令人滿意。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 型高效液相色譜儀;MULTIFUGEX3R 型離心機;T25 Digital型渦旋振蕩儀;N1型氮吹儀;ML-204型電子天平(感量0.001 g);C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)。

抗氧化劑標準儲備溶液:2 000 mg·L-1,稱取BHA、BHT、OG、DG、PG、NDGA、THBP、TBHQ和Ionox-100等9種抗氧化劑標準品各20.00 mg,分別置于10 mL 棕色容量瓶中,用含0.1 g·L-1AP 的乙腈溶液定容,配制成質量濃度為2 000 mg·L-1的抗氧化劑標準儲備溶液,于-18 ℃避光保存。

抗氧化劑混合標準溶液:200 mg·L-1,分別移取上述9種抗氧化劑標準儲備溶液各1 mL 置于同一10 mL容量瓶中,用含0.1 g·L-1AP的乙腈溶液定容,搖勻,配制成質量濃度為200 mg·L-1的抗氧化劑混合標準溶液,現配現用。

抗氧化劑混合標準溶液系列:將200 mg·L-1抗氧化劑混合標準溶液用含0.1 g·L-1AP的乙腈溶液逐級稀釋,配制成質量濃度分別為2.00,5.00,10.0,20.0,40.0,80.0 mg·L-1的抗氧化劑混合標準溶液系列,現配現用。

乙腈飽和的正己烷溶液:取800 mL正己烷,加入200 mL乙腈,搖勻靜止后取上層即得。

正己烷飽和的乙腈溶液:取800 mL乙腈,加入200 mL正己烷,搖勻靜止后取下層即得。

食用油購自某市場。

BHA、BHT、OG、DG、PG、NDGA、THBP、TBHQ 和Ionox-100標準品的純度均不小于98%;AP為分析純;甲醇、正己烷和乙腈為色譜純。

1.2 儀器工作條件

Agilent Eclipse XDB-C18色 譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫35 ℃;進樣量10μL;檢測波長280 nm;流量1 mL·min-1;流動相A 為0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～4.00 min時,B為5%;4.00～12.00 min時,B由5%升至60%;12.00～22.00 min時,B由60%升至75%;22.00～25.00 min時,B由75%升至95%;25.00～28.10 min 時,B 由95%降 至5%,保 持1.90 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品提取

稱取試樣1.000 g置于50 mL 離心管中,加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液溶解樣品,渦旋1 min,用10 mL正己烷飽和的乙腈溶液(含0.1 g·L-1AP)渦旋提取2 min,以轉速6 000 r·min-1離心5 min,收集乙腈層置于試管中,再重復使用10 mL正己烷飽和的乙腈溶液(含0.1 g·L-1AP)提取2次,合并3 次提取液,待凈化。同時做空白試驗。

1.3.2 樣品凈化

用甲醇5 mL 活化C18固相萃取柱,再用乙腈5 mL平衡,棄去流出液。將上述合并的提取液傾入C18固相萃取柱中,用體積比2∶1的乙腈-甲醇混合液5 mL洗脫,收集上樣時的流出液和洗脫液置于試管中,于40℃氮吹至近干,用含0.1 g·L-1AP的乙腈溶液2 mL定容,經0.22μm 有機濾膜過濾,按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 GB 5009.32-2016第一法的試驗結果

參照GB 5009.32-2016第一法的樣品提取凈化過程和高效液相色譜條件進行空白基質(陰性食用油)加標試驗,考察了該方法下9種抗氧化劑的分離效果(圖1),并計算得到9種抗氧化劑的加標回收率。

圖1 采用GB 5009.32-2016第一法時9種抗氧化劑的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 9 antioxidants by the first method of GB 5009.32-2016

結果顯示:在完全采用GB 5009.32-2016第一法的色譜柱和流動相洗脫程序情況下,PG 峰形較差,THBP峰和TBHQ 峰未能達到基線分離,DG和BHT 出峰較晚;另外,9種抗氧化劑的加標回收率偏低(31.4%～90.1%),尤其是TBHQ、Ionox-100和BHT 的加標回收率均低于70.0%。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱

試驗首先選用較短的Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5μm)對抗氧化劑混合標準溶液和實際食用油樣品進行分析,所得色譜圖見圖2。

圖2 采用柱長為150 mm 的色譜柱時的色譜圖Fig.2 Chromatograms obtained by chromatographic column with the column length of 150 mm

由圖2可知:混合標準溶液中的9種抗氧化劑能得到較好分離,但實際樣品中食用油基質組分復雜,出現明顯干擾,如四級菜籽油中TBHQ 峰與基質組分未達到完全分離;芝麻油中基質組分在Ionox-100出峰處(18.554 min)出現一未知雜質(經質譜驗證不是Ionox-100),嚴重影響Ionox-100 的測定。

為獲得良好分離,試驗考察了Agilent Eclipse XDB-C18、SHISEIDO C18、Waters C18等3種柱長為250 mm 的色譜柱對9 種抗氧化劑分離效果的影響。結果表明:采用SHISEIDO C18和Waters C18色譜柱測定時,部分抗氧化劑(如PG、THBP)的峰形較差,THBP峰和TBHQ 峰不能完全分開,影響積分結果,定量分析誤差大;而采用Agilent Eclipse XDB-C18柱測定時,9種抗氧化劑全部出峰,出峰時間合適,峰形對稱,分離度相對較好。因此,試驗選用Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)作為色譜柱。

2.2.2 流動相

試驗考察了1.5%(體積分數,下同)乙酸-甲醇、1.5%乙酸-甲醇與乙腈混合液(體積比為7∶3)、0.1%甲酸-乙腈等3種流動相體系對9種抗氧化劑分離效果的影響,所得色譜圖見圖3。

由圖3可知:在其他色譜條件相同的情況下,以1.5%乙酸-甲醇體系、1.5%乙酸-甲醇與乙腈混合液(體積比為7∶3)體系為流動相時,9種抗氧化劑出峰時間延遲,且THBP峰與TBHQ 峰部分重疊;以0.1%甲酸-乙腈體系為流動相時,9種抗氧化劑能清晰完全分離,并且峰形對稱。因此,試驗選擇0.1%甲酸溶液-乙腈體系作為流動相,在30 min內完成9種抗氧化劑的測定。

圖3 3種流動相下9種抗氧化劑的色譜圖Fig.3 Chromatograms of 9 antioxidants with 3 mobile phases

2.2.3 柱 溫

試驗考察了柱溫分別為30,35 ℃時對80.0 mg·L-1抗氧化劑混合標準溶液的分離效果的影響。結果表明:當柱溫為30 ℃時,出峰時間接近的BHA 峰和OG 峰不能完全分開,影響定量分析;當柱溫為35℃時,各組分能較好分離,且峰形較好,沒有明顯的拖尾現象。因此,試驗選擇柱溫為35 ℃。

2.2.4 洗脫梯度

由于測定芝麻油和四級菜籽油時存在較為明顯的基質干擾,雜質與部分抗氧化劑的保留時間接近(四級菜籽油中TBHQ、芝麻油中Ionox-100出峰處的雜峰干擾),影響定量,因此對梯度洗脫程序進行優化。結果表明:按照1.2節的梯度洗脫程序測定含基質干擾的抗氧化劑混合標準溶液,各組分均能較好分離,滿足準確定性和定量的檢測要求。

2.3 提取條件的選擇

試驗選用含AP的正己烷飽和的乙腈溶液為提取劑,與GB 5009.32-2016中第一法的提取劑正己烷飽和的乙腈溶液進行比較,其回收試驗結果見圖4。

由圖4可知:經正己烷飽和的乙腈溶液提取后,THBP、THBQ、DG 和BHT 的回收率較低;而經含AP的正己烷飽和的乙腈溶液提取后,9種抗氧化劑的回收率均高于85.0%,滿足檢測要求,原因是AP能保護抗氧化劑在提取濃縮等過程中不被氧化。因此,試驗選用含AP 的正己烷飽和的乙腈溶液作為提取劑。

圖4 不同提取劑下9種抗氧化劑回收率的比較Fig.4 Comparison of recoveries of 9 antioxidants with different extractants

GB 5009.32-2016第一法中提取劑的用量為5 mL,試驗進一步考察了提取劑含AP的正己烷飽和的乙腈溶液的用量分別為5,10 mL 時對回收試驗結果的影響。結果表明:當使用10 mL 提取劑時,9種抗氧化劑的回收率均有提高,其中BHT 的回收率顯著上升。因此,試驗選擇提取劑的用量為10 mL。

2.4 凈化柱的選擇

試驗考察了C18、C18-N、PSD、改性C18等不同凈化柱對回收試驗結果的影響,見圖5。

圖5 采用不同凈化柱時9種抗氧化劑回收率的比較Fig.5 Comparison of recoveries of 9 antioxidants with different purified columns

由圖5可知:使用C18柱和PSD 柱均能得到較高的回收率,C18主要吸附長鏈脂類化合物、甾醇及其他非極性雜質,PSD 主要吸附脂肪酸、脂類、有機酸、色素等物質。另外,由于C18柱在GB 5009.32-2016中使用,因此試驗選擇C18柱作為凈化柱。

2.5 氮吹濃縮過程的影響

在40 ℃氮吹下,按試驗方法分別測定未濃縮、添加AP濃縮和未添加AP濃縮的10.0 mg·L-1抗氧化劑混合標準溶液中9種抗氧化劑的含量。結果顯示,9種抗氧化劑在上述情況下測得的峰面積變化不大,說明40℃氮吹濃縮過程對9種抗氧化劑并未帶來明顯損失。

2.6 標準曲線和檢出限

按試驗方法對抗氧化劑混合標準溶液系列進行測定,以抗氧化劑的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明:9種抗氧化劑的質量濃度在2.00～80.0 mg·L-1內與峰面積呈線性關系,相關系數均在0.999 0以上,具體的線性參數見表1。

表1 保留時間和線性參數Tab.1 Retention times and linearity parameters

以3倍信噪比(S/N)對應的質量濃度作為檢出限(3S/N),得到9 種抗氧化劑的檢出限均為10.0 mg·kg-1。

2.7 穩定性試驗

在一段時間內(0,10,20,30,40,50,60 h),分別對樣品溶液和抗氧化劑混合標準溶液(質量濃度10.0 mg·L-1,含AP的乙腈配制)的穩定性進行考察。結果顯示,隨著時間的延長,樣品溶液和抗氧化劑混合標準溶液的質量濃度無顯著變化,不同時間點測定值的相對標準偏差(RSD,n＝6)均小于10%,說明60 h內9種抗氧化劑的穩定性良好。

2.8 精密度和回收試驗

在芝麻油、玉米油、一級菜籽油、四級菜籽油、胡麻油、橄欖油、植物調和油等7種食用油空白基質中分別添加20.0,60.0,150.0 mg·kg-1等3個濃度水平的抗氧化劑混合標準溶液,按試驗方法測定,其回收率和測定值的RSD 結果見表2。

表2 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表2 (續)

由表2 可知:9 種抗氧化劑的回收率為62.0%～104%,RSD 均小于13%,滿足測定要求。

2.9 樣品分析

采用優化后的試驗方法對市售不同種類、不同級別和不同廠家的食用油中抗氧化劑含量進行測定,包括一級菜籽油、四級菜籽油、胡麻油、橄欖油、植物調和油、玉米油和芝麻油各2批。結果表明:大部分樣品中未檢出PG、THBP、NDGA、BHA、OG、Ionox-100、TBHQ、BHT,僅2批芝麻油中檢出DG,檢出量分別為17,19 mg·kg-1。

本工作優化了GB 5009.32-2016第一法中的色譜條件、提取劑、凈化濃縮步驟,考察了優化后方法的穩定性、加標回收率、線性范圍、精密度等。結果表明該方法操作簡單、準確度高、分離效果好、靈敏度高,滿足檢測標準要求,適用于同時檢測大批量食用油中多種抗氧化劑的含量。