在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定尿液中芬太尼及其代謝物的含量

趙清佳,汪 蓉,徐智儒,盛振海,梁 晨,張玉榮?

(1.中國醫藥工業研究總院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室,上海 200040;2.上海市公安局物證鑒定中心,上海市現場物證重點實驗室,上海 200083)

芬太尼是強效的μ-阿片受體激動劑,其鎮痛作用是嗎啡的80倍,15 min起效,維持2 h,可產生欣快、呼吸抑制,大劑量產生肌肉僵直,用于各種原因引起的疼痛,但長期使用具有成癮性。芬太尼的消除半衰期(t1/2)較短,以10μg·kg-1的劑量給藥時,大鼠血液中的t1/2為3.72 h[1]。體內吸收后,尿液中芬太尼的原體或代謝物的濃度通常高于血液中的濃度,因此通過檢測尿液中的原體或代謝物來判斷吸食者的吸毒史,具有更高的參考價值,但目前對芬太尼代謝物檢測時限的報道相對較少。

芬太尼主要在肝臟中被CYP450酶迅速代謝,去甲芬太尼為其主要的代謝物[2-3]。目前,生物檢材中芬太尼的檢測方法有均相免疫測定法[4-5]、氣相色譜-質譜法[6-7]、液相色譜-串聯質譜法[8-10]等。由于生物檢材基質復雜,常常存在內源性雜質的干擾,為了延長色譜柱和儀器的使用壽命,提高目標物的檢出限,在分析樣品之前需要前處理。樣品前處理常用的方法有液液萃取法(LLE)[10]、固相萃取法(SPE)[11]和蛋白質沉淀法(PP)[12]等。其中LLE和PP均存在耗時長、溶劑需求量大、污染環境等缺點,PP還會對色譜柱造成一定程度的損壞。而對于SPE研究顯示[13],提供同樣良好的檢出限、準確度和精密度的情況下,離線SPE 需要手動活化、緩沖和淋洗等步驟,過程復雜。

本工作旨在開發一種在線固相萃取(on-line SPE)的前處理方法對尿液中的芬太尼和去甲芬太尼進行富集凈化,建立一種前處理與檢測全自動化的方法,同時將該方法用于研究芬太尼原體及其代謝物去甲芬太尼在大鼠體內的檢測時限。該方法溶劑消耗少,人力需求低,且操作簡便易行,可滿足公安及司法部門對該物質監控的需求。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo UltiMate 3000 型雙三元超高效液相色譜系統;TSQ Altis型三重四極桿質譜儀,配電噴霧離子源(ESI);Eppendorf AG 型離心機;Talboys型數顯型漩渦混合器;BRANSON B3500S-MT 型超聲波清洗器。

標準儲備溶液:稱取芬太尼和去甲芬太尼的對照品粉末10 mg,用甲醇溶解并稀釋,分別定容至10 mL容量瓶中,配制成質量濃度均為1.00 g·L-1的芬太尼標準儲備溶液和去甲芬太尼標準儲備溶液。

混合標準溶液:移取芬太尼和去甲芬太尼的標準儲備溶液適量,用甲醇逐級稀釋,分別配制成質量濃度為1 mg·L-1、10μg·L-1和100 ng·L-1的混合標準溶液。

混合標準溶液系列:移取一定質量濃度的混合標準溶液適量,用甲醇逐級稀釋,配制成質量濃度為20 ng·L-1、1,2,4,6,8μg·L-1的混合標準溶液系列。

2-(3-甲氧基苯基)-2-(乙基氨基)環己酮鹽酸鹽-d3(MXE-d3)內標儲備溶液:稱取MXE-d3對照品粉末10 mg,用甲醇溶解,轉移至10 mL 容量瓶中,用甲醇定容,配制成質量濃度為1.00 g·L-1的MXE-d3內標儲備溶液。

MXE-d3內標溶液:用甲醇稀釋MXE-d3內標儲備 溶 液,配制成 質 量 濃度為10 μg·L-1的MXE-d3內標溶液。

甲酸銨溶液:2 mmol·L-1,分別以甲酸和氨水調節p H,配制pH 4.2,7.0,9.2的2 mmol·L-1的甲酸銨溶液。

所有溶液在使用前均保存在4 ℃的冰箱中。

芬太尼、去甲芬太尼對照品的純度大于99%;MXE-d3對照品的純度大于99.5%;甲醇、甲酸和甲酸銨均為色譜純;氨水為分析純;超純水由Purelab Ultra超純水機制備。

1.2 儀器工作條件

1)在線固相萃取條件 Waters Oasis HLB固相萃取小柱(20 mm×2.1 mm,25μm);柱溫20℃;進樣量50μL;流量0.4 mL·min-1;前處理泵的流動相A 為甲醇,B為水(甲醇和水用來活化、平衡固相萃取小柱),C 為pH 9.2的2 mmol·L-1甲酸銨溶液(作為淋洗液)。梯度淋洗程序見表1。

表1 前處理泵的梯度淋洗程序Tab.1 Gradient elution program for pre-process pump

2)色譜條件[14]Thermo Fisher Hypersil GOLD C18分析柱(100 mm×2.1 mm,1.9μm);柱溫50 ℃;進樣量50μL;流量0.4 mL·min-1;分析泵的流動相D 為含2 mmol·L-1甲酸銨和0.1%(體積分數,下同)甲酸的水溶液;F 為含2 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脫程序:0～4.00 min時,D 為90%;4.00～6.00 min時,D 由90% 降 至65%,保 留4.00 min;10.00～12.00 min時,D 由65% 降 至35%;12.00～12.50 min時,D 由35%升至90%,保留2.50 min。

3)質譜條件[14]ESI,正離子模式,選擇離子監測(SRM)模式;離子傳輸管溫度325 ℃,霧化器溫度325 ℃;鞘氣流量12 L·min-1,輔助氣流量8 L·min-1。表2 列出了目標物和內標物的質譜參數。

表2 質譜參數Tab.2 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備和在線固相萃取

移取尿液樣品200μL 至2.0 mL 離心管中,添加10μg·L-1MXE-d3內標溶液4μL,混勻,加入pH 9.2的2 mmol·L-1甲酸銨溶液200μL稀釋,渦旋30 s后,以轉速13 000 r·min-1離心10 min。移取上清液200μL置于進樣小瓶中,單次上樣50μL。

移取空白尿樣180μL 至2.0 mL 離心管中,分別添加20μL混合標準溶液系列,配制成加標樣品,其余步驟同上。

將上述制備的樣品加至固相萃取小柱上,前處理泵和分析泵同時開啟工作。0～2 min時,六通閥切換至6-1,用前處理泵的流動相洗脫固相萃取小柱,此時目標物被選擇性地保留和純化;2～4 min時,六通閥切換至2-1,此時分析泵與在線固相萃取小柱成串聯模式,以分析泵的初始流動相將目標物從固相萃取小柱洗脫至分析柱上;4 min開始,再次將六通閥切換至6-1,用前處理泵清洗、再生固相萃取小柱,用分析泵分離目標物。整個程序由Xcalibular軟件控制自動完成。在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜(UHPLC-MS/MS)的流路圖見圖1。

圖1 在線固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜的流路圖Fig.1 Diagram of on-line SPE combined with UHPLC-MS/MS

1.3.2 動物試驗

試驗動物:Sprague Dawley(SD)大鼠,雄性,質量200～230 g。

藥液配制:移取1.00 g·L-1的芬太尼標準儲備溶液40μL至15 mL 的微量離心管(EP 管)中,加0.9%氯化鈉溶液至10 mL,配制成4 mg·L-1的溶液。

給藥方法:SD 大鼠3 只,分別以20μg·kg-1的給藥劑量尾靜脈注射給藥。

樣本收集:給藥后,分別于0,2,4,24,48,72,96,120,144,168,192,216,240,264,288,312,336,360,384,408,432,456,480,504,528,552,576,600,624,648,672 h收集尿液樣本,編號,置于-40 ℃的冰箱冷凍保存。

2 結果與討論

2.1 前處理泵的淋洗液及淋洗時間的選擇

由于目標物是堿性化合物,為了抑制離子化效應,同時減少淋洗過程中目標物的流失,試驗分別以pH 7.0的2,5,10 mmol·L-1的甲酸銨溶液和pH 9.2的2,5,10 mmol·L-1的甲酸銨溶液為淋洗液清洗基質中極性較強的雜質。芬太尼和去甲芬太尼在采用不同淋洗液時的響應值見圖2。

圖2 目標物在采用不同淋洗液時的響應值Fig.2 Response values of the target compounds by using different eluants

結果表明:固相萃取小柱在6種淋洗液條件下均能很好地萃取到目標物。但以pH 9.2 的2 mmol·L-1甲酸銨溶液為淋洗液時,目標物具有更優的峰形和更高的響應值,5μg·L-1的尿液加標樣品中,芬太尼和去甲芬太尼的響應值分別為5.88×106和5.08×106。因 此,選 擇pH 9.2 的2 mmol·L-1甲酸銨溶液作為淋洗液。

將通過在線固相萃取小柱后的廢液直接連接至質譜檢測器,發現采用該淋洗液進行淋洗,5 min內色譜圖無目標物出峰,說明無目標物的流失。設置為全掃描模式,發現在2 min前有雜質出峰,2 min后無其他雜峰出現,表明該淋洗液在2 min內足以將基質中的雜質清洗干凈,因此將淋洗時間設置為2 min。

2.2 洗脫程序的選擇

為了快速將目標物轉移至分析柱,減少譜帶的展寬,試驗采用反沖的方式將目標物轉移至分析柱。試驗發現,分析流路的初始流動相即可將所有目標物洗脫至分析柱。將流路中的分析柱拆去,用兩通替代,色譜出峰時間在3.6 min內,據此可以確定閥切換的時間應該略晚,因此將閥切換時間設置在4 min時切換固相萃取小柱,確保目標物全部進入分析流路。然后以分析泵的流動相對分析柱上的目標物進行梯度洗脫,同時前處理泵對在線固相萃取小柱進行清洗再生、活化和平衡,二者互不干擾,縮短了分析時間。通過上述色譜條件與閥切換時間的優化后,目標物可獲得較好的分離效果。

2.3 樣品稀釋液的酸度的影響

正常新鮮尿液的pH 為4.5～7.9,而試驗中的目標物為堿性物質,因此有必要考察樣品稀釋液的酸度對目標物測定的影響。試驗分別采用pH 為4.2(酸性),7.0(中性),9.2(堿性)的2 mmol·L-1甲酸銨溶液作為樣品稀釋液,考察了其萃取效果的影響。芬太尼和去甲芬太尼在不同酸度的樣品稀釋液下的響應值見圖3。

圖3 目標物在不同酸度的樣品稀釋液下的響應值Fig.3 Response values of the target compounds in dilute solutions at different acidity

結果表明:SPE色譜柱在不同酸度的樣品稀釋液下均能很好地萃取到芬太尼和去甲芬太尼。相比之下,使用堿性樣品稀釋液時,目標物解離減少,更多的保留在固相萃取小柱上,因而具有更高的響應值。因此,選擇pH 9.2的2 mmol·L-1甲酸銨溶液作為樣品稀釋液。

2.4 方法的專屬性

收集6份來自不同健康志愿者的空白尿液樣本,并按試驗方法進行處理分析,檢測背景響應,結果顯示空白樣品中目標物和內標物均無干擾。芬太尼、去甲芬太尼和內標MXE-d3的保留時間分別為9.94,7.79,8.02 min,400 ng·L-1的質控樣品及200ng·L-1的MXE-d3內標溶液的色譜圖見圖4。

圖4 目標物和內標物的色譜圖Fig.4 Chromatograms of the target compounds and internal standard

儀器通過高含量樣品后進空白樣品來估計色譜柱的殘留情況。結果表明,通過高含量樣品后,芬太尼不存在殘留;去甲芬太尼有少量殘留但通過1針空白樣品清洗后可以消除。

2.5 基質效應、標準曲線與檢出限

由于在線前處理的系統設計不能直接得到固相萃取后目標物的回收率[13,15],按照《中華人民共和國藥典》2015年版中在線前處理樣品的基質效應的考察方法,本試驗收集6批不同健康志愿者的空白尿液,分別添加低、高濃度水平的芬太尼和去甲芬太尼,制得基質匹配的混合標準溶液,按試驗方法進行預處理和進樣分析,考察目標物的響應的總變異系數。總變異系數＝標準偏差/平均值×100%,若總變異系數不大于15%,說明基質無干擾。結果顯示:6批樣品中,芬太尼的響應的總變異系數不大于2.5%,去甲芬太尼響應的總變異系數不大于7.1%,均符合要求,說明基質對樣品測定無影響。

配制芬太尼和去甲芬太尼的質量濃度分別為2.00,100,200,400,600,800 ng·L-1的混合標準溶液系列,按照試驗方法進樣分析。以目標物的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線,其線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表3。

表3 線性參數Tab.3 Linearity parameters

檢出限定義為信噪比(S/N)不小于3的最低目標物的質量濃度,測定下限定義為信噪比不小于10的最低目標物的質量濃度。結果顯示,在優化的色譜條件下,芬太尼和去甲芬太尼的檢出限(3S/N)均為0.200 ng·L-1,測定下限(10S/N)均為2.00 ng·L-1。該方法的檢出限高于文獻[16]報道的芬太尼的最高檢出限(0.003μg·L-1)。

2.6 精密度和回收試驗

分別將測定下限、低、中、高等4個濃度水平的混合標準溶液進行預處理和進樣分析。當天制備樣品,每個濃度水平平行測定5次,計算得到回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),考察日內精密度。連續3 d同一時間測定混合標準溶液,計算得到回收率和測定值的RSD,考察日間精密度(《中華人民共和國藥典》2015 年版僅監測2 d),所得結果見表4。

由表4可知:測定值的RSD 均小于15%,說明方法的精密度較好。

2.7 穩定性試驗和稀釋效應

按試驗方法測定低、高濃度水平的混合標準溶液,每個濃度水平平行測定3次來評估樣品的穩定性。由于SD 大鼠體內代謝后目標物的濃度遠遠超過線性范圍,因此分別設定稀釋因子1 為稀釋2 000倍、稀釋因子2為稀釋200倍和稀釋因子3為稀釋20倍,每組平行測定5次,來考察方法的稀釋可靠性。結果表明,芬太尼和去甲芬太尼的短期穩定性(室溫放置4 h)、預處理后自動進樣盤中的穩定性(放置24 h)、凍融穩定性(每隔24 h,室溫解凍20 min,再放入-40 ℃冷凍保存,循環3次)、長期穩定性(-40 ℃冷凍保存10 d)的測定值的RSD 均小于14%,稀釋可靠性的測定值的RSD 均小于3%。說明在考察的稀釋倍數范圍內,其基質不影響結果的精密度,稀釋具有可靠性。

2.8 SD大鼠尿液中芬太尼原體和代謝物去甲芬太尼的檢測時限

芬太尼原體在SD 大鼠體內2 h時達到最高,最高量 為112.66 μg·L-1,24h時迅速下降至2.58μg·L-1,芬太尼原體在1號和2號SD 大鼠體內的檢測時限為5 d,第6 d陰性;在3號SD 大鼠體內的檢測時限為7 d,第8 d陰性。代謝物去甲芬太尼在SD 大鼠體內4 h 時達到最高,最高量為1.6 mg·L-1,之后迅速下降,緩慢消除,去甲芬太尼在1號SD 大鼠檢測時限為26 d,第27 d陰性,在2號SD 大鼠的檢測時限為25 d,第26 d陰性,在3號SD 大鼠內的檢測時限為28 d,第29 d陰性。結果表明,去甲芬太尼在體內的消除期緩慢且較長,檢測時限遠遠超過了芬太尼原體,對于吸入更大劑量芬太尼的吸食者來說,可能會需要更長的檢測時間。

相對于已報道的文獻[16-17],本方法具有更高的靈敏度,因此芬太尼原體的檢測時限由3 d延長至7 d,去甲芬太尼28 d的檢測時限也尚未見過報道。SD 大鼠尿液中芬太尼原體和代謝物去甲芬太尼的濃度-時間曲線如圖5所示。

圖5 大鼠尿液中芬太尼原體和代謝物的濃度-時間曲線Fig.5 Concentration-time curves of fentanyl prototype and its metabolite in rat urine

本工作通過建立在線固相萃取的前處理方法,優化了程序設計、淋洗液、樣品稀釋液的酸度等條件,建立了完整的在線固相萃取技術結合超高效液相色譜-串聯質譜的分析方法,進行了動物試驗并發現去甲芬太尼長達28 d的檢測時限。該方法操作簡單,自動化程度高,分析結果良好,可為公安及司法部門判斷當事人是否吸食芬太尼提供參考。