部分電化學(xué)還原氧化石墨烯修飾玻碳電極用于苦參堿的測定

陶 菡,黃 銳,劉 豐,田運(yùn)霞,吳遠(yuǎn)根

(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550025)

苦參堿(MT)屬于四環(huán)喹諾里西啶類生物堿,廣泛存在于苦參、山豆根、苦豆子等中藥的根中[1-2]。MT 是目前的研究熱點(diǎn)[3-4],它不僅具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗寄生蟲、抗腫瘤、抗過敏和抗骨質(zhì)疏松等活性[5-6],還具有毒性小、成本低等優(yōu)點(diǎn),可將其開發(fā)成生物制劑(如苦參堿注射液),用于實(shí)際臨床治療。因此,建立一種簡便、快速、靈敏的測定生物制劑中MT 含量的方法,對于MT 含量的監(jiān)控具有十分重要的意義。

目前,MT 的測定方法主要有毛細(xì)管電泳法(CE)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)等[7-8]。但這些方法均存在操作步驟繁瑣、檢測時(shí)間較長或儀器成本高昂等缺點(diǎn),極大地限制了其應(yīng)用。相比而言,電化學(xué)法具有操作簡單、耗時(shí)短、靈敏度高和成本低等特點(diǎn),可將其應(yīng)用于MT 含量的測定。

電化學(xué)法中電極表面的修飾材料的選擇非常關(guān)鍵。氧化石墨烯(GO)是一種表面含有豐富含氧官能團(tuán)的二維碳納米材料[9],具有大的比表面積和良好的生物相容性,可用作電極修飾材料[10-11]。然而,含氧官能團(tuán)的存在引入了sp3缺陷,導(dǎo)致GO 導(dǎo)電性較差[12-13],可采用電化學(xué)法對其進(jìn)行直接、高效地還原[14],得到還原度可控的還原GO[15]。據(jù)此,本工作采用恒電位法(IT)一步制備了部分電化學(xué)還原氧化石墨烯(p Er GO)修飾的玻碳電極(GCE),將其作為工作電極(p Er GO/GCE),并用于MT 注射液中MT 含量的測定,以期為MT 生物制劑的質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI 660C型電化學(xué)工作站;A-10型超純水儀;SB-5200 DTD 型超聲清洗機(jī)。

MT 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.0×10-2mol·L-1,稱取0.248 4 g MT 標(biāo)準(zhǔn)品,以水稀釋定容配制而成。使用時(shí)用水稀釋至所需濃度。

MT 標(biāo)準(zhǔn)品純度不小于98%;MT 注射液(50 mg/5 mL);GO、Na H2PO4、Na2HPO4等試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

三電極體系:p Er GO/GCE為工作電極,鉑絲為對電極,Ag/AgCl為參比電極;電解質(zhì)為0.1 mol·L-1Na H2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH 7.0),測定前通氮?dú)獬ト芙庋?富集電位為開路電位;富集時(shí)間120 s;差分脈沖伏安法(DPV),掃描電位區(qū)間為0.4～1.4 V,電位增量4 m V,脈沖寬度0.05 s,采樣寬度16.7 ms;測試溫度為室溫。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 GCE的預(yù)處理

分別用0.3,0.05μm 的Al2O3粉末將GCE 的表面拋磨至鏡面,然后依次用純凈水、乙醇、超純水超聲,將電極清洗干凈,并在0.1 mol·L-1Na H2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH 7.0)中用循 環(huán)伏安法(CV)進(jìn)行活化,掃描電位-0.5～1.2 V,掃描速率0.05 V·s-1,直到得到穩(wěn)定的CV 曲線。

1.3.2 修飾電極的制備

將25 mg GO 超聲分散于5 mL 水中,將6μL GO 分散液滴涂在GCE 表面,室溫下晾干,即得到GO/GCE。將 GO/GCE 置 于0.1 mol· L-1Na H2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH 7.0)中,采用IT還原電極表面的GO,還原電位為-0.75 V,還原時(shí)間為200 s,即可得到p Er GO/GCE。

1.3.3 樣品的測試

用0.1 mol·L-1Na H2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH 7.0)將MT 注射液稀釋1 000倍,按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 pEr GO/GCE制備條件的選擇

2.1.1 GO 電化學(xué)還原方法

分別采用IT 和CV 還原GCE 上的GO,對比得到的2種修飾電極對1.0×10-4mol·L-1MT 標(biāo)準(zhǔn)溶液的DPV 電化學(xué)響應(yīng),結(jié)果見圖1。

由圖1可知:2種方法制備的修飾電極最大響應(yīng)電流對應(yīng)的還原電位分別為1.04 V(IT 還原)和1.09 V(CV 還原);與CV 還原制備的修飾電極相比,采用IT 還原制備的修飾電極的響應(yīng)電流更大,峰形更對稱。因此,試驗(yàn)選擇IT 還原制備修飾電極。

圖1 2種方法還原制備的修飾電極對MT 的DPV 響應(yīng)曲線Fig.1 Curves showing DPV response of modified electrodes prepared by the 2 reduction methods to MT

為了考察2種還原方法所獲得GO 的還原度,采用CV 分別記錄2種修飾電極在0.1 mol·L-1Na H2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH 7.0)中的電化學(xué)行為,結(jié)果見圖2。

圖2 不同修飾電極在Na H2 PO4-Na2 HPO4 緩沖溶液(pH 7.0)中的CV 響應(yīng)曲線Fig.2 Curves showing CV response of different modified electrodes in the Na H2 PO4-Na2 HPO4(pH 7.0)buffer solution

由圖2可知:不還原時(shí),修飾電極在-1.1 V 處有一個(gè)較大的還原峰,是由GO 含氧官能團(tuán)還原得到的(曲線1);IT 還原后,該處的還原峰強(qiáng)度明顯減弱(曲線2);CV 還原后,還原峰幾乎消失(曲線3),這表明IT 還原的GO 仍保留了部分含氧官能團(tuán),而CV 還原的GO 則幾乎被完全還原。圖1和圖2的結(jié)果表明:IT 還原獲得的p Er GO 比CV 獲得的完全還原氧化石墨烯Er GO 對MT 具有更好的響應(yīng)性能,可能原因是p Er GO 上還殘留的部分含氧基團(tuán)為MT 提供了更多的電極結(jié)合位點(diǎn)。

2.1.2 還原電位和還原時(shí)間

還原電位是影響GO 還原度的重要因素,還原電位越高,還原度越小[15]。試驗(yàn)考察了還原電位對MT 峰電流的影響,結(jié)果顯示:當(dāng)還原電位為-0.75 V 時(shí),MT 的峰電流最大。這是由于電位過低時(shí),GO 的含氧官能團(tuán)幾乎都被還原,MT 在電極上的附著位點(diǎn)較少,導(dǎo)致峰電流較低;還原電位過高時(shí),GO 還原度較低,電極導(dǎo)電性較差,導(dǎo)致峰電流較低;而還原電位為-0.75 V 時(shí),GO 的含氧官能團(tuán)被部分還原,電極不僅導(dǎo)電性較好,且含有較多附著位點(diǎn),故峰電流最大。

試驗(yàn)還考察了還原時(shí)間對MT 峰電流的影響,結(jié)果顯示:當(dāng)還原時(shí)間為200 s時(shí),MT 的峰電流最大。

因此,在制備修飾電極時(shí),試驗(yàn)選擇的還原電位為-0.75 V,還原時(shí)間為200 s。

2.2 MT的電化學(xué)行為

試驗(yàn)考察了1.0×10-4mol·L-1MT 標(biāo)準(zhǔn)溶液在GCE、GO/GCE 和p ErGO/GCE 上的DPV 電化學(xué)響應(yīng)行為,以及p Er GO/GCE 對添加MT 前后的0.1 mol·L-1Na H2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH 7.0)的響應(yīng),結(jié)果見圖3。

圖3 DPV 響應(yīng)曲線Fig.3 DPV response curves

由圖3(a)可知:MT 在GCE 上的氧化峰峰電流較小,峰形較差,說明GCE 對MT 的電催化活性不好(曲線3);MT 在GO/GCE上的峰電流較GCE略高,但峰形仍然很差(曲線2);MT 在p Er GO/GCE上的峰電流較大且峰形較好,說明p Er GO/GCE對MT 具有較好的電催化能力(曲線1)。由圖3(b)可知:p Er GO/GCE在空白電解質(zhì)中無DPV響應(yīng)(曲線4′),加MT 后,產(chǎn)生了明顯的氧化峰,說明氧化峰是由MT 的氧化行為產(chǎn)生(曲線4)。

2.3 電化學(xué)檢測條件的選擇

2.3.1 電解質(zhì)及電解質(zhì)酸度

試驗(yàn)考察了p Er GO/GCE 分別在pH 均為7.0的Na H2PO4-Na2HPO4、KH2PO4-NaOH、H3BO3-Na2B4O7、K2SO4、NaCl溶液中對MT 的DPV 電化學(xué)響應(yīng)行為,結(jié)果見圖4。

圖4 MT 在不同電解質(zhì)中DPV 響應(yīng)曲線Fig.4 Curves showing DPV response of MT in different electrolytes

由圖4可知:修飾電極在不同電解質(zhì)中對MT均有響應(yīng),但在Na H2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中MT 的峰電流最大且峰形較好。因此,試驗(yàn)選擇Na H2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH7.0)作為電解質(zhì)。

試驗(yàn)考察了p Er GO/GCE 在不同酸度的Na H2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中對MT 的DPV 電化學(xué)響應(yīng)行為,結(jié)果見圖5。

由圖5可知:隨著電解質(zhì)酸度的降低,氧化峰峰電位左移,說明有質(zhì)子參與了MT 的氧化反應(yīng);氧化峰峰電流隨著酸度的降低先升高后降低,當(dāng)電解質(zhì)酸度達(dá)到pH 7.0時(shí),峰電流較大。因此,試驗(yàn)選擇的電解質(zhì)酸度為pH 7.0。

圖5 MT 在不同酸度電解質(zhì)中DPV 響應(yīng)曲線Fig.5 Curves showing DPV response of MT in electrolytes with different acidity

2.3.2 富集時(shí)間和富集電位

試驗(yàn)考察了富集時(shí)間對MT 氧化峰峰電流的影響,結(jié)果顯示:峰電流隨著富集時(shí)間的延長而增加,這是由于富集時(shí)間會(huì)增加MT 在電極表面的富集量;當(dāng)富集時(shí)間大于120 s時(shí),峰電流基本不變,說明MT 在電極表面的富集量基本達(dá)到飽和。因此,試驗(yàn)選擇的富集時(shí)間為120 s。

試驗(yàn)還考察了富集電位對MT 峰電流的影響,結(jié)果顯示:富集電位對峰電流幾乎沒有影響。因此,試驗(yàn)選擇的富集電位為開路電位。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在優(yōu)化的儀器工作條件下,用p Er GO/GCE 對8.0×10-6,1.0×10-5,2.0×10-5,4.0×10-5,6.0×10-5,8.0×10-5,1.0×10-4mol·L-1MT 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定。以MT 的濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的氧化峰峰電流為縱坐標(biāo)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性范圍為8.0×10-6～1.0×10-4mol·L-1,線性回歸方程為y＝0.104 8x＋0.202 4,相關(guān)系數(shù)為0.995 0。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),所得結(jié)果為4.0μmol·L-1。

2.5 精密度試驗(yàn)

按照儀器工作條件用p ErGO/GCE 對1.0×10-4mol·L-1MT 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行5次平行測定,測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8%,說明所建方法重現(xiàn)性較好。

按照試驗(yàn)方法制備5 支p Er GO/GCE,并對1.0×10-4mol·L-1MT 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,測定值的RSD 為2.3%,說明所建方法再現(xiàn)性較好。

2.6 回收試驗(yàn)

取MT 注射液樣品稀釋后(標(biāo)示值為40.26×10-3mol·L-1)用p Er GO/GCE 進(jìn)行測定,平行測定5次,測定值為37.90×10-3mol·L-1,RSD 為3.6%,與標(biāo)示值的相對偏差為-5.9%。另取一份樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)(先加標(biāo),再稀釋),并計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.1 Results of test for recovery(n＝5)

由表1可知:MT 的回收率為94.8%～104%,說明本方法的準(zhǔn)確度較好。

2.7 干擾試驗(yàn)

試驗(yàn)考察了100倍的乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖和200 倍的Na＋、Zn2＋、NO3-、K＋、SO42-、Cl-對MT 測定結(jié)果的干擾。結(jié)果表明:以上物質(zhì)均不干擾MT 的測定,所得相對誤差均在±5%以內(nèi),說明p Er GO/GCE具有一定的抗干擾能力。

2.8 方法比對

和文獻(xiàn)中相關(guān)方法進(jìn)行了比對,結(jié)果見表2,其中MWCNT/GCE 為多壁碳納米管(MWCNT)修飾的GCE。

表2 不同方法比對結(jié)果Tab.2 Comparison results of the different methods

表2 (續(xù))

由表2可知:和其他方法相比,本方法所得的線性范圍較窄,且濃度較低,檢出限也較低,說明本方法適用于低濃度MT 的測定。

本工作建立了基于p Er GO/GCE 測定MT 含量的DPV 電化學(xué)法,該方法具有較低的檢出限,較好重現(xiàn)性、再現(xiàn)性和準(zhǔn)確度,并具有一定的抗干擾能力,可為較低濃度的MT 的測定提供技術(shù)參考。