NaCl 脅迫對轉BADH- 反義4CL 基因二色胡枝子盆栽苗的影響

解小娟

（山西省投資咨詢和發展規劃院，山西 太原 030009）

二色胡枝子（Lespedeza bicolor）是豆科胡枝子屬（Lespedeza）多年生落葉灌木，具有生物量大、枝葉營養豐富，耐旱、耐寒、耐瘠薄、萌蘗能力強等優良特性，是荒坡綠化、礦山生態修復的先鋒樹種，同時也是優良的木本飼料作物、園林觀賞植物和藥用植物。盡管二色胡枝子具有較多優點，但仍然存在抗鹽堿能力差、木質素含量高等缺點。目前，應用基因工程技術提高植物的抗鹽堿能力、控制木質素的合成已在多種植物中取得成功[1]。甜菜堿被認為是最好的滲透調物質，甜菜堿醛脫氫酶（BADH）是甜菜堿合成的關鍵酶之一，轉入BADH 的美麗胡枝子耐鹽能力提高[2-3]。4-香豆酸輔酶A 連接酶（4CL）是控制木質素合成的關鍵性酶，可以利用不同底物來調控木質素的合成，轉入反義4CL 基因的楊樹木質素含量降低。本試驗以轉入BADH、反義4CL 基因的二色胡枝子為材料，研究不同濃度的氯化鈉處理對其生理指標的影響，以探討外源基因的導入對植物滲透調節的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為同時煉苗出瓶的非轉基因二色胡枝子，以及分子檢測呈陽性的轉BADH-反義4CL 基因二色胡枝子的2 個株系（67號、85號）。

所有試驗材料經12個月盆栽，苗木高達80～90cm時進行NaCl 脅迫。NaCl 處理濃度分別為0、0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L，每種材料處理8 盆，每盆澆灌處理液300mL，隔4d澆灌一次，共3 次，12d后每種材料每個梯度挑選生長一致的葉片進行各項生理指標的測定。

1.2 試驗方法

BADH 活性和甜菜堿含量的測定方法：BADH 活性測定參照羅曉麗等的方法。甜菜堿含量測定采用雷氏鹽紫外分光光度計法[4]。

相關生理指標測定方法：細胞膜透性采用電導儀法[5]。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[6]。脯氨酸含量測定采用的酸性茚三酮比色法。可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法[6]。抗氧化酶活性的測定根據李合生法[6]。

每種指標重復測定3 次，試驗結果用DPS 軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對BADH 活性和甜菜堿含量的影響

為了進一步分析外源基因（BADH）的功能，對轉基因二色胡枝子2 個陽性株系進行不同梯度的鹽脅迫處理，同時以非轉基因二色胡枝子為對照，測定鹽脅迫條件下植株的BADH 活性和甜菜堿含量（見圖1、圖2）。結果表明：隨著鹽濃度的提高，BADH活性和甜菜堿含量都有所提高。無鹽脅迫時，轉基因株系與對照植株BADH 活性和甜菜堿含量含量較低，且不存在顯著性差異；NaCl 濃度為2g/L 時，轉基因株系67號BADH 活性和甜菜堿含量是對照植株的2.5 倍和1.61 倍，轉基因株系85號BADH 活性和甜菜堿含量是對照植株的3 倍和1.66 倍，且轉基因株系與非轉基因植株存在顯著性差異。同時BADH 活性增加的幅度高于甜菜堿含量增加幅度。因而，鹽脅迫條件下轉基因二色胡枝子具有較強的滲透調節能力，降低了鹽脅迫對葉片細胞造成的傷害，抗性增強。

圖1 不同NaCl 濃度下BADH 的活性變化

圖2 不同NaCl 濃度下甜菜堿含量的變化

2.2 鹽脅迫對細胞膜透性和丙二醛含量的影響

鹽脅迫對非轉基因和轉基因二色胡枝子膜透性的影響如圖3所示，隨著鹽濃度的增加，非轉基因和轉基因二色胡枝子相對電解質滲透率（EL）呈上升趨勢。無鹽脅迫條件下，非轉基因和轉基因二色胡枝子相對電解質滲透率含量較低，且不存在顯著性差異；NaCl 濃度為0.5g/L 時，與無鹽脅迫時相比，非轉基因植株的EL 增加1.67 倍，轉基因株系67號和85號分別增加0.76 倍和1.08 倍，且轉基因株系和非轉基因植株存在顯著性差異；NaCl 濃度為1.0g/L 和2.0g/L，轉基因株系的EL 增加的幅度均小于非轉基因植株。結果表明鹽脅迫條件下轉基因二色胡枝子EL 比非轉基因植株低，說明轉基因植株膜結構完整性較好，膜受到傷害較小，抗鹽性強，說明外源基因（BADH）導入提高了植株的抗鹽性。鹽脅迫對非轉基因和轉基因二色胡枝子丙二醛（MDA）含量的影響如圖4所示，隨著鹽濃度的增加，非轉基因和轉基因二色胡枝子MDA 含量與電導率趨勢的一致。無鹽脅迫條件下，轉基因株系和非轉基因植株MDA 含量較低，且不存在顯著差異；NaCl 濃度為0.5g/L 時，與無鹽脅迫時相比，非轉基因植株的MDA 含量增加45%，轉基因株系67號和85號分別增加13%和9%，且轉基因株系和非轉基因植株存在顯著性差異；NaCl 濃度為1.0g/L和2.0g/L，轉基因株系的MDA 含量增加的幅度均小于非轉基因植株。結果表明鹽脅迫條件下轉基因二色胡枝子MDA 含量比非轉基因植株低，說明轉基因植株膜脂過氧化程度較低，膜結構傷害的程度較小，進一步說明外源基因（BADH）導入提高了植株的抗鹽性。

圖3 不同NaCl 濃度下電導率的變化

圖4 不同NaCl 濃度下丙二醛的變化

2.3 鹽脅迫對脯氨酸含量的影響

鹽脅迫對非轉基因和轉基因二色胡枝子脯氨酸（Pro）含量的影響如圖5所示，隨著鹽濃度的增加，非轉基因和轉基因二色胡枝子Pro 含量呈現先上升后下降的趨勢。無鹽脅迫時，非轉基因植株和轉基因各株系間的脯氨酸含量較低，且不存在差異顯著；NaCl 濃度為0.5g/L 時，與無鹽脅迫時相比，非轉基因植株的Pro含量增加0.48 倍，轉基因株系67號和85號分別增加2.97 倍和2.47 倍，且轉基因株系和非轉基因植株存在顯著性差異；NaCl 濃度為1.0g/L 時，轉基因株系的Pro 含量增加的幅度仍大于非轉基因植株；非NaCl 濃度為2.0g/L 時，脯氨酸含量下降，但轉基因株系的Pro 含量仍高于非轉基因植株。結果表明，鹽脅迫條件下轉基因二色胡枝子的Pro 含量高于非轉基因植株，說明鹽脅迫下轉BADH 二色胡枝子滲透調節能力較強。

圖5 不同NaCl 濃度下脯氨酸含量的變化

2.4 鹽脅迫對可溶性蛋白含量的影響

鹽脅迫對非轉基因和轉基因二色胡枝子可溶性蛋白含量的影響如圖6所示，隨著鹽濃度的增加，非轉基因和轉基因二色胡枝子可溶性蛋白含量呈現下降的趨勢。無鹽脅迫時，非轉基因植株和轉基因各株系間的可溶性蛋白含量較高，且不存在差異顯著；NaCl 濃度為0.5g/L 時，與無鹽脅迫時相比，非轉基因植株的可溶性蛋白含量降低了30.4%，轉基因株系67號和85號分別降低了17.9%和14.4%，且轉基因株系和非轉基因植株存在顯著性差異；NaCl 濃度為1.0g/L 和2.0g/L 時，轉基因株系可溶性蛋白的含量降低的幅度仍小于非轉基因植株。結果表明，鹽脅迫條件轉BADH 二色胡枝子可溶性蛋白含量高于非轉基因植株，說明在鹽脅迫下轉基因二色胡枝子比非轉基因植株蛋白質分解速度慢、抗性強。

圖6 不同NaCl 濃度下可溶性蛋白的變化

2.5 鹽脅迫對抗氧化酶活性的影響

鹽脅迫對非轉基因和轉基因二色胡枝子過氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性的影響如圖7～圖9 所示，隨著鹽濃度的增加，非轉基因和轉基因二色胡枝子SOd活性呈現上升的趨勢，POD、CAT 活性呈現先上升后下降的趨勢。無鹽脅迫時，非轉基因植株和轉基因株系的SOD、POD、CAT 活性較低，且不存在顯著性差異；NaCl 濃度為0.5g/L 時，非轉基因植株和轉基因株系的SOd活性增強幅度較小，67號與非轉基因植株不存在顯著性差異，85號與非轉基因植株存在顯著差異，非轉基因植株和轉基因株系的POd活性也增強幅度較小，且轉基因株系和非轉基因植株不存在顯著性差異，而非轉基因植株和轉基因株系的CAT 活性也增強幅度較大，轉基因株系與非轉基因株系存在顯著性差異；NaCl 濃度為1.0g/L 時，與非轉基因植株相比，非轉基因植株的SOd活性增強0.56 倍，轉基因株系67號和85號分別增強0.99 倍和0.83 倍，非轉基因植株的POd活性增強0.89 倍，轉基因株系67號和85號分別增強2.21倍和2.06 倍，非轉基因植株的CAT 活性增強1.35 倍，轉基因株系67號和85號分別增強1.61 倍和1.74 倍；NaCl 濃度為2.0g/L時，非轉基因植株和轉基因株系的SOd活性仍呈增強趨勢，且轉基因株系SOd活性增加的幅度大于非轉基因植株，而非轉基因植株和轉基因株系的POd和CAT 活性卻降低，但轉基因株系的POd和CAT 活性仍高于非轉基因植株。結果表明，鹽脅迫條件下轉BADH 基因二色胡枝子的抗氧化酶活性高于非轉基因植株，說明鹽脅迫下轉基因二色胡枝子抗氧化酶活性維持在較高水平，其抗性較強。

圖7 不同NaCl 濃度下SOd活性的變化

圖8 不同NaCl 濃度下POd活性的變化

圖9 不同NaCl 濃度下CAT 活性的變化

3 討論

甜菜堿作為一種非毒性滲透調節物質，在植物受到環境脅迫時在細胞內積累并降低滲透勢，還能作為一種保護物質具有極為重要的“非滲透調節”功能，維持生物大分子的結構和完整性，維持其正常的生理功能，解除高濃度鹽對酶活性的毒害和保護呼吸酶及能量代謝的過程[7]。大量研究結果表明，本試驗采用NaCl 對轉基因二色胡子BADH 基因進行誘導。Ishitani 等在300mmol·L-1NaCl 脅迫條件下的大麥葉片中，BADH 的mRNA 含量比對照增加了8 倍，在無鹽條件下，BADHmRNA 的量就恢復到接近正常的狀態。McCue 等發現當NaCl 的濃度從零逐漸增加到500mmol·L-1時，菠菜葉片中的BADH 的mRNA 含量增加3～4倍。本試驗結果也證實了這點，鹽脅迫下轉基因二色胡枝子BADH 表達明顯增加，NaCl 濃度為2%時，轉基因株系67號BADH 活性和甜菜堿含量是對照植株的2.5 倍和1.61 倍，轉基因株系85號BADH 活性和甜菜堿含量是對照植株的3 倍和1.66倍，這與其他鹽脅迫條件下誘導BADH 基因表達的相關報道一致[8]。上述研究結果表明，甜菜堿含量的積累與鹽脅迫誘導密切相關，甜菜堿在合成的過程中相關基因的表達可能受鹽濃度調控；此外不同株系間BADH 活性和甜菜堿含量也存在一定差異，可能與外源BADH 基因插入的位點及甲基化程度有關。

植物受到鹽脅迫情況下，將發生離子區域化作用，即植物細胞將吸收的大量鹽離子貯存于液泡從而降低細胞質中的鹽濃度，減少鹽離子對細胞的毒害，但隨著液泡和細胞質之間的滲透勢差增大，最終會導致細胞質失水，造成機械損傷；同時植物在抗逆脅迫下細胞內自由基如羥自由基、超氧自由基、單線態氧等會引發膜脂過氧化，造成細胞膜系統的損傷，膜透性增加，使細胞內的大量的無機離子和氨基酸、可溶性糖等小分子外滲[9]。本試驗證明，轉BADH-反義4CL 基因二色胡枝子在鹽脅迫下膜結構較穩定，膜透性變化較小，MDA 積累較少，膜脂過氧化程度較低，受到的傷害較小，因而抗鹽性較強。

脯氨酸是一種很好的相容性溶質，作為滲透調節劑和滲透保護劑的效應十分廣泛和顯著，不僅起著降低細胞內水勢的作用，而且能有效地保護和穩定各種酶系以及復合體四級蛋白的四級結構，并能維持細胞膜系統在逆境中的穩定性，充當活性氧的清除劑，降低膜脂過氧化等。在正常環境中脯氨酸含量較低，只有在鹽脅迫等逆境條件下脯氨酸的合成反應才被激活。本試驗研究結果表明，轉基因二色胡枝子葉片中脯氨酸含量顯著高于對照，這與耐鹽程度的高低與脯氨酸含量呈正相關的報道相一致。但有些研究卻表明，脯氨酸的積累與耐鹽程度成負相關[10]。也有些人則認為脯氨酸的積累是傷害的結果，不能作為抗性篩選的指標，更適宜作為一個脅迫傷害指標[11]。

植物在逆境脅迫條件下，可溶性蛋白分解速度加快，合成減少，因而蛋白質含量下降，氨基酸含量增多。劉世琦曾報道植物可溶性蛋白中50%以上是酶蛋白，其含量的高低可間接反映代謝活動的強弱[12]。本試驗研究結果表明，在鹽脅迫條件下轉基因植株可溶性蛋白的含量高于非轉基因植株，間接說明轉基因植株代謝活動比非轉基因植株強。

CAT、POd和SOd均為植物內源的自由基清除劑，屬于保護酶系統。植物在正常條件下，自由基水平較低不會引起傷害，此時自由基的產生與清除處于一種動態平衡之中，但在高鹽濃度脅迫條件下，這種動態平衡受到破壞，自由基產生積累，膜脂過氧化。因此，鹽脅迫下只有保護酶活性增強或維持較高水平，才能清除活性氧自由基使其保持較低水平，防止生物膜的破壞，從而保持一定的耐鹽性。本研究結果表明，鹽脅迫條件下，轉基因株系CAT、POd和SOd活性均高于非轉基因植株，但鹽濃度增加到2.0%時，保護酶的活性有所下降，這可能與高鹽濃度下植物的保護酶系統受到破壞有關。