動脈溶栓聯合自體骨髓間充質干細胞治療股骨頭壞死

史 躍,王安明,陳啟忠,朱麗麗,劉軍權,丁 凱,高從敬

近年來,干細胞的移植和組織工程是最引人關注的課題,自體骨髓間充質干細胞(MSC)移植在骨壞死的治療領域中得到應用。我科采用動脈溶栓聯合自體灌注介入治療股骨頭缺血性壞死 30例,取得了滿意的療效,報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2006年 1月至 2008年 12月,采用動脈溶栓聯合自體 MSC治療股骨頭缺血性壞死患者 30例(觀察組)。其中 16例有外傷史,28例有飲酒史,無大量應用激素。單側 21例,雙側 9例。男24例,女 6例。年齡 26～48歲,平均 36.5歲。病史3個月 ～1年。并與同期單純采用介入導向動脈溶栓 34例(對照組)作比較。全部病例均有治療前、后血管造影片及 CT、MRI片,診斷明確。Ficat和Arlet分期[1]：觀察組Ⅰ期 2例,Ⅱ期 18例,Ⅲ期 7例,Ⅳ期 3例;對照組Ⅰ期 1例,Ⅱ期 16例,Ⅲ期 11例,Ⅳ期 6例。兩組比較無統計學意義(P＞0.05),有可比性。

1.2 骨髓間充質干細胞培養方法 抽取患者骨髓20 ml,肝素抗凝,用人 MSC分離液分離單個核細胞,吸取單個核細胞,用 pH7.4 PBS洗 3次,將細胞懸浮于 15%胎牛血清 DMEM F12培養基中,置37℃,5%CO2培養箱中培養。3天后棄懸浮細胞繼續用上述培養基培養貼壁細胞,細胞生長至底面積的 70%時用乙二酸四乙氨二鈉(EDTA)胰酶消化貼壁細胞后傳代培養。標本從采集到分離時間不超過1 h。顯微鏡下每天觀察細胞生長及增殖情況。分別取各代 MSC,置于有小玻片的 6孔板中,待細胞80%～90%貼壁生長后取出,用 10%中性甲醛固定,蘇木精染色,顯微鏡下觀察細胞形態。經 3～5代培養后 MSC即可達到治療數量。細胞培養板更換含有 10-7mmoL/L地塞米松、10 mmol/Lβ-磷酸甘油、0.05mmol/L維生素 C和 15%胎牛血清的成骨分化誘導液,培養 3周,每周換液 2次,分別于誘導的第 7、14天取出部分細胞固定,觀察細胞形態學變化并進行組織學染色。收集體外向成骨細胞誘導第 14天的 MSC制備成 20ml細胞懸液供患者治療使用,MSC數量約為 1×107～1×108個。

1.3 主要觀察指標[2]①臨床指標：干細胞移植后隨訪觀察患者髖關節疼痛程度、疼痛性質及疼痛時間變化、行走距離及步態變化、髖關節外展與內旋功能變化。②數字減影血管造影術(DSA)及 X線攝片檢查指標：干細胞移植后 6個月行股骨頭供血動脈造影術,觀察血管新生及股骨頭供血動脈充盈情況;每 6個月行髖關節 X線片檢查,觀察股骨頭區骨質變化。

1.4 關節活動度參照標準[3]0級：髖關節屈伸、外展、內收、外旋、內旋度數總和為 260°～320°為正常;1級：髖關節屈伸、外展、內收、外旋、內旋度數總和為 259°～190°,功能稍受限,生活基本自理;2級：為 189°～ 160°,功能部分受限;3級 ：為 159°～130°,功能明顯受限;4級：為﹤130°,功能嚴重受限。

1.5 治療方法 常規下采用 seldinger技術,經皮-股動脈穿刺,用 COOK或 Cordis 5.0 FCobra導管常規行患側股動脈、髂內動脈 DSA。以 6ml/s注射速度,6幀/s連續采集圖像,連續采集 20 s,根據 DSA表現,了解旋股內、外動脈、閉孔動脈的起源及股骨頭血供。觀察組將 5.0 F Cobra導管選擇至患側旋股內動脈、旋股外動脈或閉孔動脈,灌注脲激酶 40萬 U,罌栗鹼 30 mg。然后經 5.0 F導管送入 3.0 F微導管,超選擇至旋股內動脈股骨頭供養血管分支,經微導管緩慢灌注 MSC懸液,術后靜脈滴注低分子右旋糖酐 500m l,連續 5天。對照組將 5.0 F Cobra導管選擇至患側旋股內動脈、旋股外動脈或閉孔動脈,直接灌注脲激酶 40萬 U,罌栗鹼 30mg。兩組間隔 2、4周再進行第 2、3次介入治療,3次為一療程。觀察股骨頭血管數量及粗細變化、血管密度改變及股骨頭造影染色情況。囑患者臥床或患肢避免負重2～3個月,在此期間服用鈣劑、活血類藥物改善微循環,同時進行功能鍛煉。

1.6 統計學處理 樣本數據組間比較采用 χ2檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 DSA表現 本組 64例股骨頭區血供主要由旋股內動脈、旋股外動脈的分支供養(圖 1A)。38例表現為缺血型,觀察組 18例,對照組 20例,DSA主要表現為股骨頭分支血管稀、細、少或呈落葉后的柳樹枝狀(圖 1B);17例表現為淤血型,觀察組 8例,對照組 9例,主要為股骨頭區呈團狀血管增多,靜脈期呈湖狀改變(圖 1C);9例表現為混合型,觀察組 4例,對照組 5例,主要表現為血管阻塞、缺血和淤血同時存在(圖 1D)。經過溶栓、擴張血管,動脈灌注體外向成骨細胞誘導第 14天的 MSC懸液 20 ml,治療 1個療程后,對比同一時相 DSA圖像,股骨頭頸區域血管數量及粗細變化。觀察組 29例表現為狹窄閉塞血管再通或明顯出現側支循環血管,同區域血管明顯增多、增粗并延長,靜脈回流通暢,股骨頭血管染色區域明顯增大(圖 1E)。

2.2 關節活動度 見表 1。觀察組治療前、后關節活動度比較有顯著性差異(P＜0.01),觀察組與對照組治療后關節活動度的比較無差異(P＞0.05)。

表1 兩組治療前、后關節活動度的比較(例)

2.3 骨質變化的影像學表現 治療 1個療程后,經6～18個月的隨訪觀察。早期(3～6個月)骨囊變區骨質增生硬化不明顯,后期(6～18個月)骨囊變區縮小,骨質增生硬化明顯,股骨頭壞死區域逐漸縮小。觀察組為 29例,有效率為 96.7%(29/30);對照組為 29例,有效率為 85.3%(29/34)。

2.4 髖部疼痛 治療 1個療程后,觀察組疼痛消失22例,明顯減輕 4例,輕度減輕 3例,無變化 1例,有效率為 96.7%(29/30);對照組疼痛消失 19例,明顯減輕 8例,輕度減輕 3例,無變化 4例,有效率為88.2%(30/34)。

圖1 股骨頭缺血性壞死數字減影血管造影表現

3 討 論

3.1 MSC治療股骨頭缺血性壞死的臨床意義 股骨頭缺血性壞死的發病可能與成骨細胞及骨髓基質細胞的功能下降有關[4]。多項實驗及臨床研究證實骨髓干細胞體外分離培養后,在一定誘導條件下,可以向血管內皮細胞、神經細胞及成骨細胞方向分化[5]。我們采用介入法在溶栓的基礎上,經旋股內動脈灌注 MSC懸液,通過對股骨頭缺血性壞死30例 3個療程的治療,發現股骨頭壞死區表現為狹窄閉塞血管再通或明顯出現側支循環血管,同區域血管明顯增多、增粗并延長,靜脈回流通暢,股骨頭血管染色區域明顯增大;壞死股骨頭囊變區縮小,骨質增生硬化明顯,股骨頭壞死區域逐漸縮小。

3.2 MSC治療股骨頭缺血性壞死的前景 隨著干細胞工程技術的興起和發展,干細胞治療股骨頭缺血性壞死成為研究熱點。特別是對 MSC研究的不斷深入,股骨頭缺血性壞死的發病機理有了新的認識,治療方法也有了新的進展,給股骨頭缺血性壞死帶來了新的希望。Hernigou等[6]和 Ganji等[7]分別使用自體骨髓細胞修復股骨頭壞死病灶清除后的缺損,均取得良好療效。楊曉鳳等[2]使用外周血及骨髓干細胞移植治療缺血性疾病,證實干細胞形成新生血管直接改善血供?？梢娡ㄟ^骨髓干細胞動脈灌注治療股骨頭缺血性壞死,既有利于股骨頭血液供應的恢復,又能提高局部成骨能力,從而促進壞死骨的修復,對早期股骨頭壞死的治療是有利的,目前多與其他療法合并應用[8]。

[1]趙德偉.股骨頭缺血壞死的修復與再造[M].北京：人民衛生出版社,1998：19-48.

[2]楊曉鳳,王紅梅,許憶峰,等.經動脈骨髓干細胞移植治療股骨頭壞死 63例[J].中國臨床康復,2006,10(13)：3-5.

[3]張孟增,劉滄君,路志福,等.骨髓內減壓與加壓注藥在成人股骨頭壞死中的應用[J].實用放射學雜志,2001,17(5)：369-371.

[4]Gangji V,Hauzeur JP,Schoutens A,et al.Abnormalities in the replicative capacity of osteoblasitic cells in the proximal femur of patients with osteonecrosis of the femoral head[J].JRheumatol,2003,30(2)：348-351.

[5]Xu WR,Qian H,Zhu W,et al.Anorel tumor cell line cloned from mutated human embryonic bone morrow mesenchymal stem cells[J].Oncology Reports,2004,12(3)：501-508.

[6]Hernigou P,Beaujean F.Treatment of osteonecrosis with autologous bone marrow grafting[J].Clin Orthop,2002,405(1)：14-23.

[7]Ganji V,Hauzeur JP,Matos C.Treatment of osteonecrsis of the femoral head with implantation of autologousbonemarrow cells[J].Bone JointSurg Am,2004,86(6)：1153-1160.

[8]Mont MA,Jones LC,Hungerford DS.Nontraumatic osteonecrosis of the femoral head：ten years later[J].JBone Joint Surg Am,2006,88(5)：1117-1132.