苯酰菌胺原藥和水分散粒劑的高效液相色譜分析方法研究

陳慧萍，孟 璨，馬杜康，趙鵬躍，黃啟良

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193）

苯酰菌胺是一種苯甲酰胺類殺菌劑，由羅門哈斯公司（現(xiàn)為陶氏農(nóng)業(yè)科學公司）研發(fā)，兼具保護和治療作用。原藥為白色精細粉末，具有類似甘草的氣味。熔點為159.5～161℃；蒸氣壓小于1×10-2mPa（小于或等于45℃）；分配系數(shù)：KowlgP值為3.76（20℃）；相對密度為1.38（20℃）。溶解度：在水中溶解度為0.681 mg/L（20℃）；在丙酮中溶解度為55.7 g/L（25℃）。水溶液中水解DT50約為15 d（pH為4和7）、8 d（pH為9）[1]。苯酰菌胺可有效防治由卵菌綱真菌引起的病害，對葡萄霜霉病有特效，對部分子囊菌和擔子菌病害也有較好的生物活性[2]。

目前，關(guān)于苯酰菌胺分析方法的報道較少。有文獻報道用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測葡萄中苯酰菌胺含量的方法[3]。張春榮等[4]報道了用氣相色譜分析黃瓜及土壤中苯酰菌胺含量的方法。李皓[5]利用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測了香椿等芽菜類蔬菜中苯酰菌胺的含量。遲夢宇等[6]建立了一種液相色譜-質(zhì)譜法測定梨中苯酰菌胺含量的分析方法。然而，苯酰菌胺農(nóng)藥產(chǎn)品的檢測方法尚無報道，其原藥及制劑中有效成分含量的測定尚無標準方法。筆者建立了在同一液相條件下測定苯酰菌胺原藥和水分散粒劑的方法，為苯酰菌胺農(nóng)藥制劑產(chǎn)品質(zhì)量檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260-DAD高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司公司；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18不銹鋼柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、KQ3200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；有機過濾器（微膜孔徑為0.45 μm）。

乙腈（色譜純）、二次蒸餾水、苯酰菌胺標準品（質(zhì)量分數(shù)99.7%），F(xiàn)irst Standard公司；96%苯酰菌胺原藥、75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑，市場購買獲得。

1.2 液相色譜操作條件

流動相：乙腈＋水（體積比為65∶35）；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm進樣體積：5 μL；保留時間：苯酰菌胺約10.4 min。

上述液相色譜操作條件是典型的操作參數(shù)，可以根據(jù)不同儀器特點和溫度條件，對給定的操作參數(shù)進行適當?shù)恼{(diào)整，以獲得最佳效果。典型的苯酰菌胺標準品、96%苯酰菌胺原藥、75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑樣品高效液相色譜圖見圖1、2、3。

圖1 苯酰菌胺標準品高效液相色譜圖

圖2 96%苯酰菌胺原藥高效液相色譜圖

圖3 75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑高效液相色譜圖

1.3 測定步驟

1.3.1 標準樣品的配制

稱取含0.10 g（精確至0.000 01 g）苯酰菌胺標樣于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇，超聲波振蕩10 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。用移液管移取10 mL上述溶液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾。

1.3.2 試樣溶液的配制

稱取含0.10 g（精確至0.000 01 g）苯酰菌胺的試樣于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇，超聲波振蕩15 min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。用移液管取10 mL上述溶液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾。

1.3.3 測定

在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標樣溶液，直至相鄰2針苯酰菌胺峰面積相對變化小于1.2%后，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.3.4 計算

將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中苯酰菌胺的峰面積分別進行平均。試樣中苯酰菌胺質(zhì)量分數(shù)按公式（1）計算。

式中：w為試樣中苯酰菌胺質(zhì)量分數(shù)，%；A2為試樣溶液中苯酰菌胺峰面積的平均值，mAU·s；m1為苯酰菌胺標樣的質(zhì)量，g；P為標樣中苯酰菌胺質(zhì)量分數(shù)，%；A1為標樣溶液中苯酰菌胺峰面積的平均值，mAU·s；m2為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

根據(jù)苯酰菌胺物化性質(zhì)，選擇甲醇作為溶劑溶解樣品，并以乙腈和水作為流動相。將流動相按不同比例在色譜柱上進行試驗，隨著乙腈比例的增加，保留時間減小，當乙腈與水比例達到70∶30時，有雜質(zhì)峰干擾苯酰菌胺，峰純度達不到試驗要求，最終選擇乙腈＋水體積比為65∶35作為流動相，流速1.0 mL/min。該條件下，苯酰菌胺色譜峰峰形較好，與雜質(zhì)能完全分離，具有良好的精密度和準確度，并且分析時間較短，提高了工作效率。

2.2 檢測波長的選擇

利用紫外-可見檢測器對苯酰菌胺溶液在210～400 nm范圍內(nèi)進行掃描。苯酰菌胺的紫外光譜圖如圖4所示，從圖中可以看到苯酰菌胺的最大吸收波長約210 nm，但在該波長處有干擾，而吸收波長在約240 nm處為次高峰，故將檢測波長確定為240 nm。

圖4 苯酰菌胺紫外吸收譜圖

2.3 分析方法的特異性

本試驗采用HPLC-DAD峰純度分析法來鑒別苯酰菌胺。苯酰菌胺標樣、96%苯酰菌胺原藥、75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑中的苯酰菌胺HPLC-DAD峰純度均大于990，有效成分處無其他物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。

2.4 分析方法的線性關(guān)系

按1.3.1標準樣品的配制方法配制標樣溶液，用甲醇以1∶1的比例梯度稀釋4次，獲得5個濃度的有效成分線性相關(guān)溶液。在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，按照分別進同樣體積的標樣，進行測定，取2次測定的平均結(jié)果。以苯酰菌胺質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。從圖5可以看出，當苯酰菌胺質(zhì)量濃度在100.07 mg/L～1 601.18 mg/L（進樣體積5 μL），與相應的苯酰菌胺峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，計算得回歸方程為y=8.296 8 x＋51.66，相關(guān)系R2=1.000 0，完全可以滿足定量分析要求。

圖5 苯酰菌胺標準曲線

2.5 分析方法的精密度

從同一樣品中稱取5個試樣，在上述色譜條件下進行分析，測得96%苯酰菌胺原藥和75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑的標準偏差分別為0.15%和0.03%（表1）。

表1 苯酰菌胺水分散粒劑分析方法的精密度試驗結(jié)果

96%苯酰菌胺原藥中苯酰菌胺質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果的變異系數(shù)為0.16，小于修改的Horwitz公式的計算值（2（1-0.51ogC）×0.67=1.35，其中C為樣品中有效成分質(zhì)量分數(shù)的平均值），表明有效成分分析方法精密度的測定結(jié)果符合要求。

75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑中苯酰菌胺質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果的變異系數(shù)為0.34，小于修改的Horwitz公式的計算值（2（1-0.51ogC）×0.67=1.96），表明有效成分分析方法精密度的測定結(jié)果符合要求。

2.6 水分散粒劑分析方法的準確度

分別稱取5個已知含量的75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑試樣于50 mL容量瓶中，加入2.4中配制的1 601.18 mg/L苯酰菌胺標樣溶液5 mL，用甲醇超聲溶解，冷卻至室溫，再用甲醇定容至刻度，搖勻。苯酰菌胺的回收率按式（2）計算。

式中：R為回收率，%；a為測定量，mg；b為所稱樣品中待測組分量，mg；c為理論加入量，mg。

經(jīng)測定，75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑中有效成分苯酰菌胺的回收率為101.50%，結(jié)果見表2，表明有效成分分析方法準確度的測定結(jié)果符合要求。

表2 苯酰菌胺水分散粒劑分析方法的準確度試驗結(jié)果

3 結(jié) 論

利用高效液相色譜對96%苯酰菌胺原藥和75%錳鋅·苯酰菌胺水分散粒劑中的苯酰菌胺進行了定性定量分析。實驗結(jié)果表明，該方法分離效果好、準確度和精密度高、線性關(guān)系良好，并且操作簡便、快速，可以進行苯酰菌胺原藥及制劑產(chǎn)品的有效成分分析。