萆祛風飲用于濕熱蘊結證痛風性關節炎大鼠的療效及機制研究

丘青中 戚子榮 邢振龍

1.廣東省中西醫結合醫院關節與創傷骨科，廣東佛山 528200；2.廣東省中西醫結合醫院手足外科，廣東佛山 528200

痛風是由于人體內嘌呤代謝失常，引起體內尿酸(UA)水平升高，尿酸鹽晶體在體內累積引發急性關節部位的紅腫熱痛為主要癥狀的一種關節及軟組織炎癥性疾病[1]，如果不及時治療與干預，可以發展為痛風石、泌尿系結石及痛風性腎病[2]。隨著目前經濟發展及生活水平的提高，飲食習慣的改變，痛風的發病率不斷升高，且愈加趨向年輕化，逐漸成為危害國民健康的一種常見代謝性疾病。目前藥物治療主要是以非甾體抗炎藥和秋水仙堿為主，但因其有胃腸道不良反應，臨床上不易長期口服[3]。中醫對痛風的認識久遠，中醫藥治療痛風效果良好，患者服用后較少出現藥物不良反應。廣東省佛山市名中醫丘青中教授師承國醫大師石仰山，一直致力于傳承與發展中醫骨傷科，在30 多年的臨床實踐中積累了豐富的治療痛風的經驗，根據多年的臨床實踐經驗總結出經驗方萆薢祛風飲[4]，主要治療濕熱蘊結證痛風性關節炎急性發作，本研究采用Mc Carty DJ[5]經典造模方法與濕熱蘊結證造模方法[6]，使用微晶型尿酸鈉誘導濕熱蘊結證大鼠痛風性關節炎模型，初步探索萆薢祛風飲對急性痛風性關節炎的作用機制，為臨床應用及推廣提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級健康SD 大鼠50 只，雄性，6～8 周齡，體重(250±20)g，廣州中醫藥大學動物實驗中心代購，實驗場地：廣州中醫藥大學動物實驗中心。實驗動物使用許可證號：syxk(粵)2016-0023，實驗動物合格證號：44203400011123。實驗動物至少飼養1 周后使用，飼養環境為溫度(22±1)℃，濕度(55±5)%，12 h 光暗循環，飼料和水均在消毒后由動物自由攝取。已通過廣東省中西醫結合醫院(以下簡稱“我院”)倫理審查，嚴格按照實驗動物有關條例進行。

1.2 儀器與試藥

1.2.1 藥劑

秋水仙堿片(云南西雙版納版納藥業有限責任公司，批號：190217)，0.5 mg/片，以蒸餾水稀釋至濃度為0.003 mg/mL 秋水仙堿溶液備用；尿酸鈉結晶(美國Sigma 公司，批號：BCBH6934Y)；萆薢祛風飲：萆薢30 g、土茯苓20 g、薏苡仁20 g、車前草15 g、蒲公英15 g、山慈菇20 g、忍冬藤20 g、地龍15 g、赤小豆12 g、赤芍12 g、川牛膝12 g。藥物購自我院藥房。煎煮方法：以上藥物適當磨碎后，放入煮藥鍋用3 倍量水浸泡30 min 后，用文火煎煮約2 h，等水量濃縮至1 倍藥物體積為止，然后將經過濾出的藥汁通過80%乙醇回流萃取，回流重復3 次取得藥液提取液，使用定性濾紙過濾，最后以恒溫60℃水浴蒸干，所得的藥液蒸干提取物置于冰箱存儲。

1.2.2 儀器

電熱恒溫水浴鍋(浙江寧波醫療器械廠，SK12-6)；精密電子天平(德國賽多利斯公司，BSA124S 型，感量：0.1 mg)；酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒(USA Sigma公司，批號：DSM2000)；大鼠半胱氨酸天冬氨酸酶(Caspase-1)抗體(上海碧云天生物科技有限公司，批號：AF2165)；臺式高速冷凍離心機(日本Hitachi 公司，CR-GⅡ)；全自動生化儀(日本日立，7150 型)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

50 只大鼠采用隨機數字表法分為空白對照組、模型組、秋水仙堿組、高劑量萆薢祛風飲組、低劑量萆薢祛風飲組，每組各10 只。

1.3.2 造模

1.3.2.1 濕熱蘊結證造模方法 空白對照組在正常環境下飼養15 d，其他四組在正常飼養基礎上，飲食上加入200 g/L 蜂蜜水自由飲用，且隔日按大鼠體重灌服豬油脂10 g/kg，共10 d，然后放入溫度為(32±2)℃，相對濕度為95%的人工氣候箱中飼養，造模時間共15 d。觀察大鼠，當出現肛溫升高、倦怠、嗜臥，大便偏稀等癥狀時，提示大鼠濕熱蘊結證造模成功[7]。

1.3.2.2 痛風性關節炎造模方法 濕熱蘊結證造模結束后，四組均以10%水合氯醛對大鼠行腹腔注射麻醉(按0.3 mL/100 g)，麻醉后取仰臥位固定。關節腔內注射：部位選取大鼠右側踝關節后側[8-10]，采用注射針以30°～40°方向插入至跟腱內側進行注射。四組則均向右側踝關節內注入0.2 mL 尿酸鈉溶液，空白對照組向右側踝關節內注入0.2 mL 生理鹽水。造模大鼠出現右側踝關節明顯腫脹，大鼠踝關節紅腫熱痛，關節屈伸不利，甚至出現三足著地的現象，提示大鼠急性痛風性關節炎造模成功[7]。

1.3.3 給藥

采用灌胃給藥方式，高、低劑量萆薢祛風飲組按大鼠與成人用藥量比進行換算，給予萆薢祛風飲藥液提取物(劑量分別為8.31、4.52 g/kg)，秋水仙堿組給予秋水仙堿溶液(按9 mg/kg)[11]，模型組和空白對照組給予等體積生理鹽水。均為1 次/d，連續7 d。

1.4 觀察指標

①大鼠關節腫脹程度：通過2 cm 試紙配合游標卡尺，分別在痛風性關節炎造模前1 h、造模后2 h 測量并記錄大鼠右側踝關節周徑，造模前1 h 數據為關節初始周徑，造模后2 h 數據為關節腫脹后周徑，關節腫脹程度(%)=(關節腫脹后周徑－初始周徑)/初始周徑×100%，計算并記錄腫脹程度，其分數與腫脹程度成正比。②血清中UA、白細胞介素(IL)-1β、Caspase-1 水平測定：在第7 天灌胃2 h 后股動脈取血，3000 r/min(離心半徑=24 cm)離心15 min，取上清液，采用全自動生化分析儀測定UA 水平，用試劑盒檢測IL-1β 及Caspase-1 水平。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件對所得數據進行分析，計量資料采用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠關節腫脹程度比較

高劑量萆薢祛風飲組關節腫脹度低于模型組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠關節腫脹程度比較(%，±s)

表1 各組大鼠關節腫脹程度比較(%，±s)

注：與模型組比較，△P ＜0.05

2.2 各組大鼠血清中UA、血清IL-1β、Caspase-1 水平比較

與空白對照組比較，模型組血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平明顯升高，差異均有統計學意義(均P ＜0.05)。與模型組比較，高劑量萆薢祛風飲組血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平降低，低劑量萆薢祛風飲組血清中UA 水平降低，差異均有統計學意義(均P ＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平比較(±s)

表2 各組大鼠血清中UA、IL-1β、Caspase-1 水平比較(±s)

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。UA：尿酸；IL-1β：白細胞介素1β；Caspase-1：半胱氨酸天冬氨酸酶

3 討論

痛風性關節炎急性發作時會激活體內炎癥細胞因子[12-13]，因此，通過抑制炎癥的連鎖反應成為緩解痛風性關節炎癥狀的一個作用靶點。在炎癥發展的早期，關節局部溫度是正常的，體內的血液中的UA 水平升高之后，原沉積在關節附近的結締組織部位的尿酸鹽晶體波動脫落。當尿酸鹽晶體的黏附性達到一定臨界值，其開始進入關節腔內并擴散，同時機體的炎癥反應控制機制隨著尿酸鹽晶體與免疫球蛋白的結合而得到激活，從而使炎癥局部的吞噬細胞聚集升高[14-17]。環氧化酶和脂氧化酶在兩者的激活下，使前列腺素及其他致炎物質[如IL、腫瘤壞死因子(TNF)]等得到促進轉化，炎癥的發展出現鏈式反應。但炎癥進展到一定時期，部分血清因子的生成(如脂蛋白β-100、某些酶類)，聯合前列腺素的共同作用，達到影響甚至抑制機體炎癥的效果，使之進入緩解期[18]。綜上而言，痛風性關節炎占據了炎癥的整個始發終末，包括炎癥早期誘導、進展及自發消退的3 個基本過程。

通過本研究數據可以看出，模型組關節腫脹程度較高，UA、IL-1β、Caspase-1 水平均較空白對照組明顯升高，從側面提示了急性痛風性關節炎激活了體內炎癥因子及炎癥反應，截斷該連鎖反應的啟動或繼發過程可能是治療痛風性關節炎的靶點之一。本研究顯示，與模型組比較，高劑量萆薢祛風飲組在緩解痛風性關節炎的關節腫脹方面均可起到良好的效果，但是低劑量萆薢祛風飲組無明顯療效，不僅提示萆薢祛風飲對急性腫脹癥狀的治療作用，還提示了其緩解腫脹癥狀需要達到一定的有效藥物濃度。在臨床實踐中，可以考慮在痛風性關節炎急性發作期關節紅腫熱痛明顯時使用萆薢祛風飲進行輔助治療。關節腫痛癥狀作為局部炎癥反應在關節部位的外在表現，萆薢祛風飲可能是通過抑制炎癥反應的進展及繼發機制發揮作用。與模型組比較，高劑量萆薢祛風飲組IL-1β、Caspase-1 水平降低，差異有統計學意義(P ＜0.05)，提示達到有效濃度的萆薢祛風飲可以通過對IL-1β、Caspase-1 的調節干擾炎癥的進展。在調控機體內UA水平方面，高劑量和低劑量萆薢祛風飲組與模型組比較均有大幅度下降，差異均有統計學意義(均P ＜0.05)，考慮萆薢祛風飲可降低大鼠體內的UA 水平，但是具體作用機制為促進UA 排泄還是減少UA 的生成途徑尚不明確，需要結合對大鼠的尿液UA 進行UA 測定方能進行下一步推測。

在治療方面，西醫的主流觀點及指南建議為在急性期，使用抗炎藥物緩解急性癥狀，并可以使用小劑量秋水仙堿預防痛風再次發作[19]。非急性期可以使用促進UA 排泄或者減少UA 生成的藥物來降低體內UA 的濃度，避免尿酸鹽結晶在人體關節沉積為痛風石。中醫藥因為臨床療效及副作用少，不失為防治痛風性關節的另一思路。廣東省佛山市名中醫丘青中教授認為痛風的病因為體內濕熱為底，在外感、受寒、濕著或汗出當風等因素下，內熱外寒相搏，瘀滯于關節，故關節

溫高作痛[19-23]。濕濁熱毒內蘊是機體內部的基礎[24-25]，外感邪毒阻滯筋脈骨節為急性發作的病機，針對此病因病機，以“祛風除濕、清瀉蘊熱”為治則擬臨床經驗方萆薢祛風飲：萆薢、土茯苓、薏苡仁、車前草、蒲公英、山慈菇、赤芍、忍冬藤、地龍、赤小豆、川牛膝。該方可以祛風為逐人體肌表經絡所受之風寒濕邪，除濕瀉熱為驅四肢郁久之濕濁熱毒，從而使筋脈骨節屈伸滑利[26]。丘青中教授在臨床上廣泛運用此方，取得良好療效，且其安全性高，較之西藥，中藥更易讓患者接受，且其標本兼治，虛實并調，真正能解除患者痛苦，降低發病率。

綜上所述，萆薢祛風飲可通過抑制IL-1β、Caspase-1介導的系列炎癥連鎖反應，緩解痛風發作的關節腫脹癥狀，從而對痛風性關節炎急性發作起到治療作用。本研究對抗炎作用與降UA 的具體機制尚未深入研究，劑量僅分為高低劑量，后續可通過加大調整藥物劑量幅度進一步探尋量效關系與最佳藥物濃度，以及進一步完善萆薢祛風飲對大鼠痛風性關節炎炎癥反應抑制的影響[24，27]，進一步研究萆薢祛風飲對濕熱蘊結證痛風性關節炎抗炎作用的機制具有重要的現實意義。