基于網絡藥理學探究轉腰湯治療退行性腰椎管狹窄癥的作用機制

李路廣 朱立國 高景華，2 高春雨 王寶劍 魏 戌 尹遜路 李 輝

1.中國中醫科學院望京醫院脊柱二科，北京 100102；2.中醫正骨技術北京市重點實驗室，北京 100102

退行性腰椎管狹窄癥(DLSS)是指由于黃韌帶增生退變等因素造成椎管、椎間孔或側隱窩狹窄，壓迫神經根或硬膜囊，從而引起以腰腿痛、間歇性跛行為主要臨床癥狀的綜合征[1]。DLSS 好發于中老年人群，現已成為嚴重影響中老年人生活質量的公共健康問題[2]。DLSS 治療主要分為手術治療和非手術治療，然而DLSS 患者往往年齡大，全身情況差，手術耐受力低，因此手術通常不作為首選治療方案[3]。明確DLSS發病機制，采用針對性藥物治療改善患者的臨床癥狀和延緩腰椎管退變的進程，減少患者對手術的需求已成為當前治療DLSS 的生物學研究熱點。轉腰湯出自清代陳士鐸《辨證錄·腰痛門》，該方是治療腰痛病的經典古方，以溫腎健脾為本，祛瘀化痰為標，治療DLSS效果顯著[4]，但其作用機制尚不明確。因此，本研究使用網絡藥理學分析轉腰湯中各成分與DLSS 之間的相互作用關系，并挖掘網絡中的關鍵節點，系統闡述轉腰湯的物質基礎及分子機制，為后續基礎研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 轉腰湯活性成分及靶點篩選

使用TCMSP 和BATMAN 中醫藥系統藥理學平臺[5-6]獲取轉腰湯所含化學成分，以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18 的藥物動力學屬性值對化合物進行篩選，另外根據文獻[7-9]補充未預測到的活性成分。使用Uniprot 蛋白質數據庫(https：//www.uniprot.org)將活性成分作用的蛋白質靶點統一轉換為基因名。

1.2 轉腰湯“活性成分-靶點”網絡構建

采用Cytoscape 3.7.2 構建轉腰湯“活性成分-靶點”網絡，其中節點(node)表示活性成分或靶點，邊(edge)表示兩者之間的關系。通過Cytoscape 3.7.2 內置“network analyzer”功能分析網絡特征參數，以研究轉腰湯中重要活性成分和靶點之間的關系。

1.3 DLSS 靶點篩選

以“Degenerative Lumbar Stenosis”“Degenerative Lumbar Spinal Stenosis”為檢索詞，通過DisGeNET(https：//www.disgenet.org)、GeneCards(https：//www.genecards.org)和OMIM(http：//www.omim.org)3 個疾病數據庫檢索DLSS 的潛在致病靶點。

1.4 轉腰湯治療DLSS 共同靶點篩選

通過Bioinformatics(http：//www.bioinformatics.com.cn/)繪制轉腰湯活性成分靶點和DLSS 致病靶點的韋恩圖。

1.5 轉腰湯成分-DLSS 致病靶點蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

將轉腰湯與DLSS 的交集靶點導入String 數據庫(https：//string-db.org)，物種設置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設置為“highest confidence：0.9”，并隱藏游離點，其余均為默認設置，獲得轉腰湯治療DLSS 的PPI 網絡。將“string_interactions.tsv”文件導入Cytoscape 3.7.2 中，運用“network analyzer”功能進行拓撲屬性分析。

1.6 轉腰湯成分-DLSS 靶點的GO 富集分析和KEGG分析

借助Metascape(http：//metascape.org)對轉腰湯治療DLSS 的核心靶點進行GO 和KEGG 分析。GO 詮釋關鍵靶點治療DLSS 的生物進程，包括生物過程(BP)、細胞組成(CC)和分子功能(MF)3 個部分。KEGG 分析詮釋關鍵靶點治療DLSS 的主要信號通路。篩選具有顯著差異的GO 和KEGG，借助ImageGP 平臺對結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 轉腰湯活性成分篩選

篩選出轉腰湯有效活性成分108 個，其中白術7 個、杜仲28 個、巴戟天20 個、防己2 個、肉桂2 個、蒼術9 個、羌活17 個、桃仁23 個。另外文獻補充有效活性成分8 個(白術：蒼術酮、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ，防己：漢防己甲素、漢防己乙素，肉桂：肉桂醛、肉桂酸)。去掉其中無蛋白靶點的成分和重復成分，共篩出有效活性成分86 個。見表1。

表1 轉腰湯主要活性成分

2.2 轉腰湯“活性成分-靶點”網絡構建與分析

通過Cytoscape 3.7.2 對轉腰湯活性成分和作用靶點的關系網絡進行分析，獲得271 個節點(185 個靶點和86 個活性成分)和908 條邊，圖中節點的大小代表相應的Degree 值，節點越大則Degree 值越大，說明其生物功能越多，重要性越高，見圖1。圖中Degree 值最大的前3 個化合物包括杜仲中的槲皮素(quercetin)和山奈酚(kaempferol)，巴戟天、杜仲、防己、桃仁和羌活的共有成分β-谷甾醇(beta-sitosterol)；Degree 值最大的前3 個基因PTGS2、PTGS1、NCOA2 是杜仲、巴戟天、防己、肉桂、羌活、桃仁的共同靶點，PTGS2 還是白術和蒼術的共同靶點，PTGS1 是蒼術的靶點，NCOA2是白術的靶點。

圖1 轉腰湯“活性成分-靶點”網絡圖

2.3 DLSS 靶點篩選

從DisGeNET、GeneCards 和OMIM 中分別檢索到1 個、1068 個和114 個與DLSS 相關的致病靶點，刪除重復值，共納入1168 個與DLSS 相關的靶點。

2.4 PPI 網絡構建與分析

韋恩圖顯示，轉腰湯和DLSS 有84 個共同作用靶點，見圖2。把84 個交集靶點提交至String，剔除11 個游離節點，通過Cytoscape 3.7.2 對“string_interactions.tsv”文件進行分析，圖中節點顏色深淺、大小和邊顏色深淺、粗細均與Degree 值相關，Degree 值大小與生物功能和生物重要性呈正相關。其中JUN、TNF、AKT1、MAPK1、白介素(IL)-6 等存在較多的交互關系，見圖3。

圖2 轉腰湯成分-退行性腰椎管狹窄癥靶點韋恩圖

圖3 轉腰湯成分-退行性腰椎管狹窄癥靶點PPI 網絡

2.5 GO 富集分析和KEGG 分析

將轉腰湯治療DLSS 的靶點上傳至Metascape 進行GO 富集分析和KEGG 分析。根據-Log10(Qvalue)值排序，選擇具有顯著性差異的GO 生物進程和KEGG通路繪制氣泡圖，見圖4(封三)。GO 共有1987 個富集結果，其中BP 有1805 個，主要涉及細胞增殖負調控、活性氧代謝過程、細胞成分運動的正調節等，見圖4A(封三)；CC 有57 個，主要涉及膜筏、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、囊腔等，見圖4B(封三)；MF 有125 個，主要涉及細胞因子受體結合、核受體活性、蛋白質結構域特異性結合等，見圖4C(封三)；KEGG通路142 條，主要有IL-17 信號通路、低氧誘導因子(HIF)-1 信號通路、NF-κB 信號通路等，見圖4D(封三)。

圖4 轉腰湯主要成分潛在靶點的富集分析(見內文第14 頁)

3 討論

DLSS 屬于中醫學“痹癥”“腰痛病”的范疇，基于“陽化氣，陰成形”理論，現代醫家認為DLSS 多因久病耗傷脾腎陽氣，陽虛則推動、溫煦等“陽化氣”功能不足；陽消陰長，久則水濕、痰瘀之邪積聚，則見黃韌帶肥厚、關節突關節增生內聚等“陰成形”功能失調；故以溫腎健脾、祛瘀化痰為治法[10]。黃韌帶附著于椎管后壁和外側壁，其增生退變導致椎管直徑減小是DLSS 發病的重要原因[3]。近年來中藥復方治療組織纖維化疾病已展現出較為廣闊的前景，在前期臨床研究中轉腰湯治療黃韌帶肥厚型DLSS 取得較好的效果[4，11]。采用現代科學手段挖掘經典古方的科學內涵，明確轉腰湯抗纖維化作用的有效成分，通過延緩或抑制黃韌帶纖維化進程將成為治療DLSS 的重要手段。

活性成分篩選結果提示槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚是轉腰湯的關鍵活性成分。Park 等[12]研究發現，黃韌帶纖維化退變與韌帶組織中成纖維細胞異常增殖和凋亡抑制密切相關。Ren 等[13]研究發現，槲皮素可通過聯合抑制mTOR、β-catenin 信號轉導途徑抑制成纖維細胞活化。而β-谷甾醇具有抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用，在清除受損細胞和維持組織器官完整上發揮著關鍵作用[14]。炎癥反應誘導組織纖維化是導致黃韌帶肥厚的主要病理機制。研究表明山奈酚可通過MAPK、AKT 等通路途徑抑制IL-1β、IL-6、IL-8 等炎癥因子的表達[15-16]。

PPI 結果提示JUN、TNF、AKT1、MAPK1、IL-6 等靶點可能是轉腰湯治療DLSS 的關鍵作用點。Nakama等[17]研究發現，在退變的黃韌帶組織中存在細胞低凋亡率的現象，而激活的c-JUN 可參與誘導細胞的凋亡[18]。腫瘤壞死因子(TNF)、IL-6 等炎癥細胞因子刺激是造成黃韌帶肥厚的主要病理誘因，且IL-6 對TNF-α 的炎癥作用具有放大效應[19]。AKT1 作為PI3K/AKT 信號通路中的關鍵調控因子參與多種組織器官的纖維化進程，因此推測轉腰湯可能通過調控AKT1抑制DLSS 患者黃韌帶的纖維化[20]。盧昌懷等[21]研究發現，p38 MAPK 在肥厚的黃韌帶組織中高度表達，而MAPK1 是MAPK 通路中的重要蛋白激酶與調控因子，因此通過調控MAPK 信號通路將為黃韌帶肥厚引起的DLSS 提供新的治療思路。

轉腰湯治療DLSS 的GO 功能富集分析提示，GO的關鍵基因靶點主要涉及細胞增殖負調控、膜筏、細胞因子受體結合等生物學過程。從KEGG 通路結果發現，轉腰湯可通過IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路、NF-κB 信號通路等轉導途徑調控DLSS 的退變進程。T 細胞分泌的炎癥細胞因子IL-17 可以刺激上皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞產生IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞刺激因子等多種細胞因子，從而介導炎癥的產生[22]。L?hr 等[23]在人肥厚的黃韌帶彈力基質區域內發現大量巨噬細胞和T 淋巴細胞的存在。另外，當IL-17 與受體結合后，可通過NF-κB、MAPK 等信號途徑發揮生物學作用[24]。HIF-1 廣泛存在于人體組織器官中。研究表明，HIF-1 信號通路可通過調控炎癥反應、誘導上皮間質轉化及調節細胞外基質沉積等發揮抗纖維化作用[25]。Nayak 等[26]研究發現，抑制PI3K、AKT 的活性可以降低下游HIF-1α 的表達，進而延緩小鼠腎纖維化進程。NF-κB 信號通路參與調節多種生理病理過程，當該通路被持續激活會導致細胞增殖和凋亡異常，另外TNF 作為NF-κB 通路上游的主要刺激信號，可參與NF-κB 信號轉導途徑的促進纖維化進程[27]。

本研究通過網絡藥理學闡釋了轉腰湯治療DLSS的藥理機制，揭示轉腰湯可以通過多靶點、多途徑治療DLSS，同時也為下一步基礎實驗研究提供理論依據。