分子影像技術(shù)導(dǎo)引乳腺癌精準(zhǔn)診療
——訪廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院執(zhí)行院長(zhǎng)張國(guó)君教授

文圖/《中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)》主筆潘鋒 記者 張浩臣

乳腺癌嚴(yán)重威脅女性健康，是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。4 月15 日“第27 屆全國(guó)腫瘤防治宣傳周啟動(dòng)儀式暨早癌防治大型專家義診”在廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院舉行，活動(dòng)期間廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院執(zhí)行院長(zhǎng)張國(guó)君教授接受了采訪。張國(guó)君教授說(shuō)，在科技部“973”子課題、國(guó)家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃等的支持下，借助分子影像技術(shù)其團(tuán)隊(duì)對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制、細(xì)胞周期可視化監(jiān)測(cè)、抗癌藥物評(píng)價(jià)體系、熒光手術(shù)導(dǎo)航等進(jìn)行了創(chuàng)新性研究，研究成果涵蓋從基礎(chǔ)研究到臨床實(shí)踐，對(duì)乳腺癌的精準(zhǔn)診療產(chǎn)生了積極的影響，推動(dòng)了學(xué)科發(fā)展和人才培養(yǎng)，相關(guān)技術(shù)方案也可為其他惡性腫瘤的研究提供借鑒。

乳腺癌死亡率未得到明顯改善

張國(guó)君教授首先介紹說(shuō)，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的2020 年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌年新發(fā)病例高達(dá)226 萬(wàn)并且每年約有68 萬(wàn)例患者死于乳腺癌，與大多數(shù)國(guó)家一樣乳腺癌位居中國(guó)女性惡性腫瘤發(fā)病首位。近年來(lái)由于母乳喂養(yǎng)率低、生育率下降等生活方式改變和女性生育模式的特殊性等原因，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率逐年升高，增長(zhǎng)速度是全球的2 倍多，我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病高峰多出現(xiàn)在45～55 歲之間，呈現(xiàn)發(fā)病年輕化趨勢(shì)。2008年，IARC 統(tǒng)計(jì)乳腺癌中國(guó)年新發(fā)病例數(shù)和年死亡數(shù)分別約占全球的12.2%和9.6%，但2020 年IARC最新報(bào)告顯示上述數(shù)據(jù)分別上升至18.4%和17.2%，我國(guó)乳腺癌防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。

張國(guó)君教授主持學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)

張國(guó)君教授指出，我國(guó)乳腺癌死亡率沒(méi)有得到明顯改善，造成這種狀況的主要原因有三個(gè)方面：一是乳腺癌的發(fā)病原因尚不完全明確，導(dǎo)致靶向治療受限。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌發(fā)病涉及生殖相關(guān)因素、遺傳因素、飲食因素、乳腺疾病史等，基因分子水平研究發(fā)現(xiàn)與乳腺癌相關(guān)的基因和細(xì)胞因子也很多，如HER2、BRCAL1、雌激素、孕激素、MMP、c-myc、Notch等，但其上下游傳導(dǎo)、控制通路以及相互之間的交互影響尚未明確，這也給靶向治療帶來(lái)了困難和難以預(yù)測(cè)性。

二是藥物療效評(píng)價(jià)方法存在缺陷。一方面，乳腺癌新輔助化療可術(shù)前控制病灶，消滅亞臨床病灶并使原先判定的不可手術(shù)變?yōu)榭墒中g(shù)。正確評(píng)估新輔助化療療效，及早發(fā)現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶，及時(shí)調(diào)整新輔助化療方案有助改善患者生存。目前臨床上常規(guī)的做法是通過(guò)測(cè)量腫瘤病灶的大小來(lái)評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物療效，如使用游標(biāo)卡尺的直接測(cè)量和應(yīng)用CT、MRI、超聲、X 線等影像學(xué)技術(shù)，通過(guò)RECIST1.1 標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)量病灶最大直徑的變化作為療效判斷的指標(biāo)。但上述評(píng)價(jià)方法需要等到病灶大小變化明顯時(shí)才可以判定，具有一定的滯后性，會(huì)使部分患者錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。

另一方面，腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物因其在分子水平更敏感，能更早期顯示腫瘤變化，因此其在評(píng)價(jià)新輔助化療療效中的作用也越來(lái)越受到重視。例如構(gòu)建并監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)報(bào)告基因可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)靶向藥物療效，但是既往分析細(xì)胞周期多采用有創(chuàng)性檢測(cè)，即獲取細(xì)胞后顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)或?qū)⒓?xì)胞固定染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA 含量，分析細(xì)胞在各個(gè)細(xì)胞周期的分布狀態(tài)，也可裂解細(xì)胞后提取蛋白，檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，而這些常規(guī)方法無(wú)法在小動(dòng)物水平實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞周期的變化。在EMT方面，一般是通過(guò)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化、Transwell 遷移、浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)、EMT 相關(guān)蛋白水平變化等來(lái)研究EMT 的過(guò)程，而這些方法僅局限于細(xì)胞水平且需要有創(chuàng)獲得或進(jìn)行細(xì)胞裂解。

三是精準(zhǔn)外科治療處于探索階段，尚未出現(xiàn)有效手段致使術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。常規(guī)的鉬靶、B 超、MRI 等影像學(xué)診斷方法只能提供腫瘤病灶大小、形狀、位置等靜態(tài)信息而不能分析其內(nèi)在基因分子改變，在診斷上具有滯后性。在手術(shù)治療方面?zhèn)鹘y(tǒng)的腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)會(huì)導(dǎo)致患者上肢水腫，嚴(yán)重影響患肢的功能；保乳手術(shù)多憑借外科醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)，采用“眼看、手摸”的方式，無(wú)法精準(zhǔn)評(píng)估安全切緣，也無(wú)法感知細(xì)小病灶，這些都是造成乳腺癌復(fù)發(fā)率和二次手術(shù)率高的直接原因。

可視化技術(shù)指導(dǎo)優(yōu)化藥物治療方案

張國(guó)君教授介紹，近年來(lái)新興的分子影像技術(shù)發(fā)展迅速，分子影像技術(shù)著眼于基因、分子、蛋白質(zhì)異常所導(dǎo)致的初始變化，對(duì)疾病具有早發(fā)現(xiàn)早診斷的潛在優(yōu)勢(shì)；同時(shí)分子影像技術(shù)能夠?qū)ν粋€(gè)體進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)的觀察，監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和診療過(guò)程中的基因、分子、蛋白質(zhì)水平變化，可以在解剖學(xué)信息發(fā)生改變之前對(duì)治療效果進(jìn)行評(píng)估，及時(shí)指導(dǎo)調(diào)整治療方案。分子影像技術(shù)的另一個(gè)重要用途是通過(guò)借助快速、高靈敏、高分辨率的成像設(shè)備與高特異性、高親和力的分子影像探針，以非侵入影像手段顯示組織水平、細(xì)胞水平和亞細(xì)胞水平的特定分子，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與分子水平的腫瘤成像。分子影像技術(shù)具有實(shí)時(shí)在體、動(dòng)態(tài)顯像、安全性高、分辨率高、無(wú)放射性等優(yōu)點(diǎn)，能對(duì)微小腫瘤精準(zhǔn)顯影從而實(shí)現(xiàn)腫瘤邊緣與位置的精準(zhǔn)判定。

利用分子影像技術(shù)，在可視化藥物療效評(píng)價(jià)方面張國(guó)君教授團(tuán)隊(duì)采用融合蛋白技術(shù)和生物發(fā)光成像手段構(gòu)建的一系列光學(xué)分子影像報(bào)告基因，可在細(xì)胞和小動(dòng)物水平上無(wú)創(chuàng)、動(dòng)態(tài)、可視化監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期的不同期別(G1、S、M、G2)的進(jìn)展，已成功用于靶向細(xì)胞周期抗癌藥物的療效評(píng)估與監(jiān)測(cè)。研究人員建立了可視化實(shí)時(shí)細(xì)胞周期報(bào)告系統(tǒng)，通過(guò)構(gòu)建系列融合Cyclins全長(zhǎng)蛋白和熒光素酶的生物發(fā)光報(bào)告基因，實(shí)現(xiàn)了可視化細(xì)胞周期進(jìn)展的不同時(shí)相。應(yīng)用這些報(bào)告系統(tǒng)可在細(xì)胞和小動(dòng)物水平對(duì)常用的細(xì)胞周期特異抗腫瘤藥物如紫杉醇、多西紫杉醇、HCPT、Palbociclib 等進(jìn)行了療效評(píng)價(jià)和劑量等的優(yōu)化。

在此基礎(chǔ)上研究人員進(jìn)一步研究了融合cyclin A2 基因全長(zhǎng)的表達(dá)蛋白cyclin A2-luc 報(bào)告基因，體外實(shí)驗(yàn)證明該融合蛋白通過(guò)泛素化依賴性途徑降解并呈細(xì)胞周期依賴性變化，其熒光強(qiáng)度即表達(dá)水平在細(xì)胞周期DNA 合成期S期達(dá)到頂峰，隨后在G2和M 期衰減，因此可用于監(jiān)測(cè)S 期特異性抗腫瘤藥物如10-Hydroxy Camptothecin 和5-FU 的作用效果。該報(bào)告基因不僅能夠可視化細(xì)胞周期進(jìn)展，而且在篩選針對(duì)S 期抗腫瘤藥物等方面也發(fā)揮了重要作用。研究團(tuán)隊(duì)還構(gòu)建了監(jiān)測(cè)EMT 分子標(biāo)志物miR-200c 的報(bào)告基因，可在體監(jiān)測(cè)miR-200c 的表達(dá)水平變化并形成了可視化乳腺癌細(xì)胞株和小動(dòng)物乳腺癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移模型，可示蹤腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，為篩選抑制腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移藥物提供了一個(gè)有效的平臺(tái)。上述研究建立的可視化細(xì)胞周期和EMT 進(jìn)程監(jiān)測(cè)模型，通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相和EMT 進(jìn)程各階段的分子標(biāo)志物變化，有助于了解靶向藥物的藥效和代謝情況，從而實(shí)時(shí)調(diào)整用藥策略并達(dá)到個(gè)體化治療的效果。

分子探針指導(dǎo)精準(zhǔn)外科

張國(guó)君教授說(shuō)，前哨淋巴結(jié)是乳腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移必經(jīng)的第一站或第一組淋巴結(jié)，前哨淋巴結(jié)活檢是腋窩淋巴結(jié)手術(shù)和分期評(píng)估的基礎(chǔ)，目前已取代傳統(tǒng)的腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)成為臨床腋窩淋巴結(jié)陰性早期乳腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)腋窩處理模式，前哨淋巴結(jié)的準(zhǔn)確定位對(duì)乳腺癌患者的精準(zhǔn)分期、預(yù)后及治療至關(guān)重要。研究團(tuán)隊(duì)成功將近紅外熒光示蹤新技術(shù)用于術(shù)中前哨淋巴結(jié)活檢與判定、微小腫瘤識(shí)別和保乳手術(shù)安全切緣評(píng)估。

張國(guó)君教授介紹，傳統(tǒng)用于術(shù)中檢測(cè)前哨淋巴結(jié)的示蹤劑有藍(lán)染料和放射性核素，但兩者均有較大的局限性。藍(lán)染料檢出率較低，假陰性率高，學(xué)習(xí)曲線長(zhǎng)，手術(shù)難度較大并可能導(dǎo)致局部組織壞死；放射性核素存在置放存儲(chǔ)使用復(fù)雜，術(shù)中檢測(cè)儀器昂貴等問(wèn)題。研究人員利用自主研發(fā)的手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)在國(guó)內(nèi)率先將近紅外熒光染料吲哚菁綠(ICG)應(yīng)用于乳腺癌前哨淋巴結(jié)活檢，成功為22 例乳腺癌患者施行了光學(xué)分子影像技術(shù)指引下的前哨淋巴結(jié)活檢，術(shù)后病理證實(shí)ICG 對(duì)前哨淋巴結(jié)檢出率達(dá)到100%，提示該技術(shù)具有可行性和臨床應(yīng)用前景。為比較ICG與臨床應(yīng)用廣泛的藍(lán)染料對(duì)乳腺癌前哨淋巴結(jié)活檢的優(yōu)劣，課題組與解放軍總醫(yī)院、弋磯山醫(yī)院開(kāi)展了多中心合作前瞻性隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ICG 對(duì)乳腺癌前哨淋巴結(jié)的檢出率達(dá)到99%，而亞甲藍(lán)組檢出率只有91.92%，假陰性率低于藍(lán)染料組，證實(shí)該技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)。這一技術(shù)在北京大學(xué)人民醫(yī)院、廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院等多家醫(yī)療機(jī)構(gòu)得到推廣應(yīng)用，其前哨淋巴結(jié)檢出率均不同程度地高于美藍(lán)，不僅假陰性率更低，可視性更好，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，縮短了學(xué)習(xí)曲線，而且在安全性方面未發(fā)現(xiàn)急性或慢性過(guò)敏反應(yīng)，只有少于10%的患者出現(xiàn)一過(guò)性皮膚色素沉著。這一科學(xué)有效實(shí)用的方法解決了我國(guó)在前哨腋窩淋巴結(jié)活檢技術(shù)方法上長(zhǎng)期存在的技術(shù)瓶頸，有利于臨床更加便捷精確地檢測(cè)前哨腋窩淋巴結(jié)。

張國(guó)君教授說(shuō)，保乳術(shù)是早期乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)方案，可以獲得更好的美容效果，提高患者術(shù)后的生活質(zhì)量，但目前常用的術(shù)中切緣評(píng)估方法大多是“眼看、手摸”，精準(zhǔn)性不足，容易導(dǎo)致對(duì)正常組織的過(guò)度切除而影響美容效果，或腫瘤殘留而增加局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)與二次手術(shù)率。來(lái)自美國(guó)乳腺外科學(xué)會(huì)的研究數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌二次手術(shù)率高達(dá)20%～55%，如何準(zhǔn)確及時(shí)判斷切緣狀態(tài)是實(shí)現(xiàn)“既減少過(guò)度切除影響美容效果又減少?gòu)?fù)發(fā)”的關(guān)鍵。

張國(guó)君教授介紹，合成靶向或特異性分子探針是精準(zhǔn)顯示切緣的第一道難關(guān)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)在多種腫瘤的進(jìn)展、侵襲性和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，研究團(tuán)隊(duì)以MMP 為靶點(diǎn)成功構(gòu)建了近紅外熒光分子探針，該探針可以在動(dòng)物活體水平精準(zhǔn)識(shí)別原位乳腺癌的腫瘤邊界且在肉眼不可及的情況下提前發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶；研究人員還構(gòu)建了RGD-HBc/ICG、白蛋白-ICG 等近紅外熒光分子探針，發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物水平其識(shí)別能力和精確度遠(yuǎn)高于常規(guī)方法，這些成果為未來(lái)乳腺癌手術(shù)導(dǎo)航和早期診療提供了全新的技術(shù)手段。近紅外熒光分子探針在多家醫(yī)院開(kāi)展的保乳手術(shù)中得到驗(yàn)證，探針的安全性、可視性、導(dǎo)引性能良好并可識(shí)別出所有的切緣陽(yáng)性標(biāo)本，與病理診斷相符，表明近紅外熒光分子探針技術(shù)可特異性地識(shí)別腫瘤邊緣，有助于手術(shù)精準(zhǔn)切除，提高保乳手術(shù)成功率。

基礎(chǔ)研究為靶向治療指出新方向

張國(guó)君教授說(shuō)，基礎(chǔ)研究是應(yīng)用研究的前提和基礎(chǔ)，其重要性不言而喻。近年來(lái)課題組系統(tǒng)闡述了以Notch3 為中心的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的作用與分子機(jī)制，探明并確定了管腔型乳腺癌中Notch3 信號(hào)通路的抑癌角色，為靶向治療指出新的靶向分子和方向。

張國(guó)君教授介紹，Notch3 在惡性腫瘤中的作用頗具爭(zhēng)議，在不同腫瘤、同一腫瘤的不同進(jìn)展階段，不同分子分型的腫瘤中發(fā)揮了不同甚至相反的作用，但其在乳腺癌中的作用尚不明確。課題組在細(xì)胞水平、小動(dòng)物水平和人乳腺癌組織標(biāo)本上對(duì)乳腺癌中Notch3 的作用進(jìn)行了系統(tǒng)扎實(shí)的研究，探索了Notch3 在乳腺腫瘤侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和EMT 中的調(diào)控機(jī)制，探明了Notch3 在乳腺癌中究竟是促癌基因還是抑癌基因的角色。研究人員首先利用臨床基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)，分析了Notch3 的表達(dá)與不同分子分型乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在ER 陽(yáng)性亞組的乳腺癌患者中Notch3 高表達(dá)的患者無(wú)復(fù)發(fā)，生存率較高，但在ER 陰性亞組則無(wú)明顯的相關(guān)性。隨后通過(guò)細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)和收集的乳腺癌組織標(biāo)本證實(shí)，Notch3 表達(dá)與ERα 呈正相關(guān)，進(jìn)一步研究證實(shí)在ERα 陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞中干擾Notch3 可引起ERα 的下調(diào)。

張國(guó)君教授說(shuō)，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，近年來(lái)的研究表明其關(guān)鍵的第一步很可能是腫瘤細(xì)胞發(fā)生了EMT。研究人員研究了Notch3 的下游調(diào)控機(jī)制以及對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，通過(guò)細(xì)胞水平功能研究證實(shí)Notch3 抑制EMT，動(dòng)物水平研究證實(shí)Notch3 可抑制遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。課題組還分析了除ERα 外的其它調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Notch3 可以轉(zhuǎn)錄上調(diào)Hippo/YAP 信號(hào)通路上的重要上游調(diào)控因子Kibra 的表達(dá)，引起YAP 蛋白排出細(xì)胞核并磷酸化降解，同時(shí)引起YAP 下游靶分子抑制，挽救實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Notch3 可通過(guò)Kibra抑制EMT。團(tuán)隊(duì)還初步探索了Notch3 的上游調(diào)控機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ID2 通過(guò)阻斷E2A 結(jié)合在Notch3 啟動(dòng)子的E-box 上，上調(diào)Notch3 的表達(dá)，抑制EMT；miR-221/222 通過(guò)抑制Notch3 的翻譯下調(diào)Notch3 的蛋白水平，促進(jìn)EMT。上述研究初步確定了Notch3在乳腺癌特別是管腔型乳腺癌中的抑癌角色，部分解決了困擾學(xué)術(shù)界的關(guān)于不同分型乳腺癌中Notch3 作用的爭(zhēng)論，為乳腺癌靶向治療指出了新的方向。

張國(guó)君教授最后說(shuō)，今年是廈門大學(xué)建校100 周年，也是廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院成立兩周年。憑借著幾十年如一日的鉆研與積累和對(duì)腫瘤科學(xué)的高度熱愛(ài)，以及對(duì)閩西南地區(qū)老百姓抗癌防癌的義務(wù)與責(zé)任，兩年來(lái)翔安醫(yī)院腫瘤診治相關(guān)學(xué)科引進(jìn)了多名腫瘤診治領(lǐng)域的知名專家并建立了單病種多學(xué)科腫瘤診療團(tuán)隊(duì)，已開(kāi)展多例疑難重癥腫瘤的復(fù)雜手術(shù)，綜合實(shí)力不斷增強(qiáng)，能夠?yàn)榛颊咛峁┳罴阎委煼桨负蜖?zhēng)取最優(yōu)的治療效果。未來(lái)翔安醫(yī)院將不斷創(chuàng)新腫瘤防治工作模式，努力建設(shè)規(guī)范化腫瘤診治中心，提高腫瘤治療質(zhì)量和安全性，同時(shí)一如既往地為大眾傳播正確的抗癌理念，持續(xù)提升人民群眾健康水平，為我國(guó)腫瘤學(xué)科發(fā)展和“健康中國(guó)”“健康廈門”建設(shè)不斷作出新的更大的貢獻(xiàn)。

專家簡(jiǎn)介

張國(guó)君，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師；國(guó)家萬(wàn)人計(jì)劃人才，新世紀(jì)百千萬(wàn)人才工程國(guó)家級(jí)人選。現(xiàn)任廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院執(zhí)行院長(zhǎng)，廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院腫瘤診治中心主任，廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院乳腺甲狀腺外科主任，廈門市內(nèi)分泌腫瘤精準(zhǔn)診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任；兼任中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)國(guó)際醫(yī)療交流分會(huì)副主任委員，中國(guó)生物物理學(xué)會(huì)分子影像學(xué)專業(yè)委員會(huì)副主任委員，中國(guó)中醫(yī)藥研究促進(jìn)會(huì)乳腺病專業(yè)委員會(huì)副主任委員，《Molecular Imaging and Biology》國(guó)際副主編等職。