23株血液分離產KPC-2肺炎克雷伯菌毒力及同源性研究*

彭成 王璐 朱正榮 趙文緊 徐元宏

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，KPN）可引起肺炎、尿路感染、血流感染和肝膿腫等感染性疾病，是醫院獲得性感染的常見病原菌之一。近年來，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistantKlebsiella pneumonia，CRKP）的分離率不斷上升[1]，患者感染后致死率較高，尤其血流感染CRKP，致死率高達70%[2]。近年有研究發現，決定肺炎克雷伯菌毒力的相關基因和碳青霉烯耐藥基因可在菌株間傳遞，形成高毒力耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，給臨床抗感染治療帶來極大挑戰。本研究對血液分離23株CRKP菌株進行毒力基因、碳青霉烯耐藥基因檢測，應用多位點序列分型方法和脈沖場凝膠電泳技術進行分子分型，現報道如下。

材料與方法

1 菌株來源 收集六安市人民醫院2018年1月～2019年12月分離自血培養的非重復CRKP菌株共23株（對厄他培南或亞胺培南耐藥菌株）。質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 1705（KPC陽性對照）系安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科惠贈。

2 主要設備與試劑 主要儀器包括：VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定藥敏儀（法國梅里埃），熱循環PCR儀T100、水平電泳儀及凝膠成像儀（美國Bio-Rad）。主要試劑：PCR試劑和Taq酶（日本Takara），亞胺培南紙片（10 μg）、厄他培南紙片（10 μg）（英國Oxoid），哥倫比亞血瓊脂平板（上海科瑪嘉），Muller-Hinton 瓊脂平板（鄭州安圖），革蘭陰性菌鑒定卡及藥敏卡（法國梅里埃），所有引物均由上海生工公司合成。

3 菌株鑒定和藥敏試驗 使用細菌鑒定儀及配套的鑒定、藥敏卡對血培養陽性轉種在哥倫比亞血瓊脂平板上的細菌進行鑒定及藥敏試驗，采用紙片擴散法復核厄他培南及亞胺培南的抑菌圈直徑，根據美國臨床實驗室標準化研究所標準操作規程（CLSI-M100-29）進行試驗操作及折點判斷。

4 拉絲試驗 用接種環將血瓊脂平板上過夜生長的菌落輕輕混勻后向上拉起，拉出長度大于5 mm黏液絲即為拉絲試驗陽性[3]。

5 碳青霉烯耐藥基因、莢膜血清型基因及毒力基因PCR檢測 采用煮沸法提取菌株DNA模板、采用PCR方法擴增常見的碳青霉烯酶基因：KPC、NDM、IMP、VIM、OXA-48及KPN的wzi基因、毒力基因：rmpA、aerobaction、kfu，引物合成及擴增條件參照文獻[4-6]進行，見表1。陽性產物由上海生工公司進行DNA雙向測序，測序結果用NCBI數據庫進行BLAST比對。

表1 主要引物序列

6 多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 參照網站（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html）合成肺炎克雷伯菌7個管家基因（rpoB、phoE、gapA、infB、mdh、tonB和pgi）引物。采用PCR進行擴增，擴增產物由北京天一輝遠公司進行雙向測序，基因序列提交至網站獲得相應的基因位點號及型號（sequence type，ST）。

7 脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE） 取哥倫比亞血瓊脂平板上過夜培養的菌落，用0.85% NaCl制備吸光度值為4.0的菌懸液，取295 μL混懸液置37℃水浴孵育10 min后與混合液（1.2%金膠，1%十二烷基磺酸鈉，0.2 mg/mL蛋白酶K）進行混勻，加入模具內，室溫放置15 min后沖洗，4℃保存。手術刀片切2 mm寬的膠塊置于100 μL稀釋液內，37℃放置30 min后，將液體吸出，再加入限制性內切酶XbaI及酶切緩沖液120 μL，37℃水浴2 h。標準菌株H9812的處理方法同上。將脈沖參數設置為：電壓6 V/cm，夾角120°，脈沖時間2.16～54.17 s，電泳時間19 h，泵設為70，溫度14℃。膠塊用EB液染色、純水漂洗后，采用凝膠成像儀獲得圖像，使用BioNumerics version 7.6軟件，選擇Dice相關系數和非加權組平均法（Unweighted Pair-group Method With Arithmetic Means，UPGMA）進行脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）結果處理和聚類分析。

結 果

1 藥敏結果 23株菌的亞胺培南和厄他培南紙片擴散法復核結果與儀器法結果一致，均為耐藥。對氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南、左氧氟沙星、環丙沙星全部耐藥。頭孢吡肟耐藥率為87%，對阿米卡星和復方新諾明的耐藥率分別78.3%和26.1%。

2 拉絲試驗及分子特征 23株菌均攜帶KPC基因，經測序比對均為KPC-2型，拉絲試驗及其余分子特征見表1。

表1 23株CRKP拉絲試驗及分子特征

3 MLST結果及最小生成樹 23株CRKP菌株中有18株為ST11型，4株為ST307型，1株為ST15型。將本次研究獲得的3種ST型與ST 1-350型一同繪制最小生成樹。使用BioNumerics 7.6.3中文版繪制，繪制方法使用BioNumerics內置MLST模板。結果顯示本次研究中ST15型與ST11型親緣關系較近，其中ST11型與主要流行的ST258型親緣關系較近。結果見圖1。

圖1 肺炎克雷伯菌分離株最小生成樹

4 脈沖場凝膠電泳結果 18株ST11型CRKP進一步分為3個PFGE型，見圖2。A型為主要型別，共16株，包括A1型（6號菌，9～11號菌，14～15號菌，19～20號菌，22號菌），A2型（7～8號菌，17～18號菌），A3（21號菌），A4（12號菌），另有B、C型各有1株。

圖2 脈沖場凝膠電泳結果及樹狀圖

討 論

本研究篩選分離自血液標本的23株非重復性CRKP，進行主要耐藥基因攜帶情況、毒力及同源性研究。23株菌主要來源于ICU病房，其次為急診內科和神經外科，與李軍[7]等報道的血液來源CRKP主要來源為ICU、新生兒科和胰膽外科一致，說明ICU病房可能是血液CRKP分離的最主要科室，其余分布各醫院之間略有差異。CRKP除對復方新諾明敏感性較高外，對其余被測抗菌藥物耐藥率均大于70%。23株菌均攜帶KPC-2基因，我們認為產KPC-2酶是我院KPN對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要原因。

近年來關于高毒力肺炎克雷伯菌（Hypervirulent Klebsiella pneumoniae，HVKP）引起臨床感染的報道不斷增加，該菌與經典KPN不同，常侵犯免疫正常人群，且感染后進展迅速，病死率較高[8]。HVKP大多拉絲試驗陽性，呈高黏液表型，與其多糖莢膜的過度表達有關。現已報道的莢膜多糖的血清型別至少有78種，其中以K1和K2型為主，但本次研究中的23株菌以K14.64型為主，與Carla Rodrigues的研究結果相似[9]，與國內部分報道不同[10]。由于本次研究僅選取了近兩年分離自血液的碳青霉烯耐藥菌株，可能不一定具有地區代表性，后續將對分離自臨床不同標本及不同耐藥表型的KPN進行wzi分型的研究，以獲取更可靠的流行病學數據。

RmpA基因負責激活莢膜產生，使菌株表現出高黏液性和強毒力性。有研究發現，具有高黏液表型以及攜帶rmpA基因的KPN菌株對小鼠表現出更高的、與莢膜類型無關的致死性毒力。本次研究的23株CRKP中，18株菌拉絲試驗陽性且同時攜帶rmpA基因，二者相關性較高，與LIN報道一致[11]，但同時有研究者發現，血液分離的CRKP未攜帶rmpA基因，僅7%攜帶rmpA2基因。之前有研究認為產KPC的KPN菌株不會同時攜帶rmpA等與毒力相關的基因[12]，但隨著時間推移，以及研究的廣泛開展，現已發現同時攜帶rmpA/rmpA2基因的CRKP[13]。Kfu基因是KPN鐵運輸系統的調節者，參與鐵的獲取，具有毒性和致病性[14]，本次試驗檢出一株攜帶kfu的ST15菌株，莢膜血清型為K19。

有研究發現，在我國產KPC-2肺炎克雷伯菌以ST11型為主[15]，本次研究23株CRKP中18株為ST11型，同樣是主要型別。PFGE進一步將這18株菌分為3個分子型，其中A1型菌株中的6株（6號菌，10～11號菌，14號菌，19～20號菌）具有完全相同的PFGE條帶，且均攜帶rmpA基因，提示這6株CRKP具有同源性，分析臨床資料發現感染該6株菌的患者均來源于ICU，該型別菌株可能是導致ICU科室內感染流行的克隆菌株。本次研究中MLST最小生成樹的繪制中存在的不足之處在于，受分析技術限制，未能將試驗所得ST型與所有目前所有已知ST型一起進行分析，但考慮到ST258型為國外主要流行型別，ST11型為我國主要流行型別，因此將ST1-350型一起繪制最小生成樹。

綜上所述，本研究中血液分離耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐藥機制主要為攜帶KPC-2基因，優勢ST型為ST11型。通過試驗發現院內已出現攜帶毒力因子的CRKP菌株，應當引起臨床和院感相關部門的重視，后續可擴大樣本范圍以及篩查其他KPN常見的毒力基因，進一步探查傳播來源及途徑。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突