藥物包被紅細胞法和藥物添加法檢測358例貧血患者抗生素類藥物性抗體結果分析*

陳鳳 鄭洋洋

抗生素的使用會導致某些患者體內出現藥物誘導性抗體，誘發貧血。實際在臨床中貧血患者相當普遍，導致其出現的原因很多，由藥物因素導致的溶血性貧血[1]也是其中之一。有文獻報道，已發現超過100多種藥物可導致溶血性貧血[2]，其中發生率最高的為抗生素類藥物，以頭孢類、青霉素類及抗炎類藥為主[3]。然而，現有的藥物性抗體的檢測方法在國內還未完全規范和廣泛應用于臨床，對于其檢測結果的意義也未引起臨床的足夠重視，導致我國對于藥物性抗體的關注度相對落后于其他國家[4]。藥物包被的紅細胞法和藥物添加法是常用的檢測藥物性抗體的方法，這兩種檢測方法雖均為微柱凝集法，但檢測原理不同，因此將兩種方法聯合起來用于藥物性抗體的檢測，可以有效提高藥物性抗體的檢出率，從而避免漏診。我們對358例應用抗生素類藥物≥3天發生貧血的住院患者標本，應用藥物包被的紅細胞法和藥物添加法兩種方法進行抗生素類藥物性抗體的檢測，并結合相關臨床資料進行綜合分析，進而提高輸血科及臨床醫師對抗生素類藥物性抗體不良影響及作用的重視。現將有關結果報告如下。

對象與方法

1 研究對象 選取2019年9月～12月我院使用抗生素類藥物≥3天后出現貧血的成年住院患者358例，按年齡分為中青年組（18歲～59歲）和老年組（≥60歲），分別為237例和121例，占比為66.2%和33.87%。其中男性108例，占總數的30.2%，女性250例，占總數的69.8%。

1.1 納入標準：就診于我院使用抗生素類藥物≥3天后出現貧血（成年男性Hb＜120 g/L，成年女性（非妊娠）Hb＜110 g/L，孕婦Hb＜100 g/L）的成年住院患者。

1.2 排除標準：原發性貧血患者、既往有繼發性貧血病史的患者、嚴重心、肝、腎功能不全患者、長期應用對紅細胞有破壞作用藥物的患者、先前用藥已導致藥物性抗體產生的患者。

2 研究方法

2.1 登記患者信息：查詢醫院HIS系統獲取患者相關臨床資料，內容包括住院號、性別、年齡、科室、輸血史、入院以來使用≥3天的抗生素的具體名稱、起止時間及臨床診斷，監測患者用藥前后的血紅蛋白、血細胞比容、總膽紅素、直接膽紅素、乳酸脫氫酶等相關實驗檢查結果。

2.2 標本收集：采集入選患者空腹靜脈血液4 mL，血標本以3 000 r/min離心4 min，提取血清用于檢測。

2.3 病例分類：將入選患者按治療方式分為手術和非手術兩組，分別為60例和298例，分別占總數的16.8%和83.2%；按使用的抗生素將患者分為應用頭孢類抗生素組和應用非頭孢類抗生素組，分別為284例和74例，占比分別為79.3%和20.7%。

2.4 抗生素種類：結合醫院臨床常用的抗生素，檢測以下幾類藥物：青霉素類（哌拉西林、阿莫西林）、頭孢類（頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢甲肟、頭孢替安、頭孢地嗪）、糖肽類（萬古霉素）、氨基糖苷類（慶大霉素）、喹諾酮類（左氧氟沙星、莫西沙星）、碳青霉烯類（美羅培南、亞胺培南）、林可酰胺類（克林霉素）。

2.5 主要試劑及儀器：抗生素類藥物致敏紅細胞試劑盒、抗生素類藥物抗體檢測試劑卡（批號分別是：20191104、20191122，均由江蘇中濟萬泰生物醫藥有限公司提供）、磷酸鹽緩沖液（pH7.2）、試劑卡孵育器（LB-C02-1，江陰力博醫藥生物技術有限公司生產）、凝膠卡離心機（LB-3000，江陰力博醫藥生物技術有限公司生產）、離心機（LC-10C，中科中佳公司生產）。

2.6 實驗方法：采用藥物包被紅細胞法和藥物添加法檢測抗生素類藥物性抗體兩種試劑，均為微柱凝膠法，具體操作如下：

2.6.1 藥物包被紅細胞法檢測抗生素類藥物性抗體：取抗生素類藥物性抗體檢測試劑卡，每份待檢患者標本標記4孔（分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。向第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ孔的每孔中加入藥物處理的紅細胞懸液25 μL，向第Ⅳ孔中加入非藥物處理的紅細胞懸液25 μL。向第Ⅰ和第Ⅳ孔中分別加入待檢標本血漿50 μL（或0.9%氯化鈉溶液1∶19稀釋的血漿50 μL），第Ⅱ孔中加入陽性對照液50 μL，第Ⅲ孔中加入陰性對照液50 μL。混勻，置試劑卡孵育器（37±1）℃孵育1 h。然后置凝膠卡離心機離心5 min （900 r/min×2 min，1 500 r/min×3 min），30 min內觀察結果并記錄。檢測結果的判定原則如下：（1）Ⅰ孔、Ⅱ孔均陽性，Ⅲ、Ⅳ孔均陰性，考慮存在藥物性抗體；（2）Ⅰ孔陽性或陰性且Ⅱ孔、Ⅳ孔均陽性，Ⅲ孔陰性，考慮存在紅細胞特異性抗原對應抗體；（3）Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ孔均陰性，Ⅱ孔陽性，考慮不存在藥物性抗體；（4）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ孔均陰性，實驗失敗，重新進行。

2.6.2 藥物添加法檢測抗生素類藥物性抗體：取抗生素類藥物性抗體檢測試劑卡一張，每份待檢患者血標本標記4孔（分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），向第Ⅰ、Ⅲ孔的每孔中加入2%～4% 正常紅細胞懸液各25 μL，向第Ⅱ、Ⅳ孔中加入2%～4% 酶處理紅細胞懸液25 μL，向第Ⅰ、Ⅱ孔的每孔中加入藥物溶液各50 μL，向第Ⅲ、Ⅳ孔中加入pH7.2 磷酸緩沖液各50 μL，向第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ孔中各加入待檢樣本血漿 50 μL。混勻，置試劑卡孵育器（37±1）℃孵育1 h。然后置凝膠卡離心機離心5 min（900 r/min×2 min，1 500 r/min×3 min），30 min內觀察結果并記錄。檢測結果的判定原則如下：（1）Ⅰ孔陽性或陰性且Ⅱ孔陽性，Ⅲ、Ⅳ孔均陰性，考慮存在藥物性抗體；（2）Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ孔均陽性，Ⅲ孔陰性，考慮同時存在藥物性抗體及酶反應性抗體；（3）Ⅱ、Ⅳ孔均陽性，Ⅰ、Ⅲ孔均陰性，考慮存在酶反應性抗體而不存在藥物性抗體；（4）Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ孔均為陽性，考慮存在血型特異性抗體。

3 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件對檢測結果進行統計學處理，計數資料以百分率（%）表示，應用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 抗生素類藥物性抗體檢測結果 358例患者的血標本中，應用藥物包被的紅細胞法共檢測出抗生素類藥物性抗體陽性12例，陽性率為3.35%；而應用藥物添加法檢測抗生素類藥物性抗體全部為陰性。

2 抗生素類藥物性抗體陽性患者臨床相關信息 將藥物性抗體陽性患者隨機編為1～12號，其相關臨床信息見表1。

表1 抗生素類藥物性抗體陽性患者信息表

3 藥物包被的紅細胞法檢測抗生素類藥物性抗體陽性患者結果 陽性患者的檢測結果見表2。

表2 藥物包被的紅細胞法檢測抗生素類藥物性抗體陽性患者的結果

4 不同分組患者藥物包被的紅細胞法藥物性抗體檢測結果 358名患者按性別、年齡、手術和非手術分別分組，檢測結果見表3。患者結果依分組各自比較，均為P＞0.05，差異無統計學意義。

表3 358名患者藥物包被的紅細胞藥物性抗體檢測結果

5 頭孢類與非頭孢類藥物性抗體檢測結果 將患者分為使用頭孢類藥物性抗體和非頭孢類藥物性抗體兩組，檢測結果見表4。兩組陽性率比較，P＜0.05，差異有統計學意義。

表4 頭孢類與非頭孢類藥物性抗體檢測結果

討 論

目前我國還未完善藥物性抗體的檢測方法，缺乏金標準，其結果的臨床意義也尚未達到共識，導致我國對于藥物誘導性抗體的相關研究和檢出率都相對落后于西方國家[4]。而本研究應用的藥物包被的紅細胞法和藥物添加法是常用的微柱凝膠抗人球蛋白法，其操作相對簡便快捷，且敏感性、準確性高，因此成為了藥物性抗體的主要檢測方法。

本研究共計358例貧血患者，應用藥物包被的紅細胞法檢測出抗生素類藥物性抗體陽性12例，陽性率約為3.35%，低于某地區327例應用抗生素的正常患者藥物性抗體陽性率4%[5]，而藥物添加法在所有患者血標本中均未檢測到抗生素類藥物性抗體，這與文獻報道某地區哌拉西林藥物性抗體的檢測結果一致[6]，究其原因可能是不同種類藥物的特性不同致其藥物性抗體產生的機制也不同，根據其藥物特性可分為半抗原型、免疫復合物型、自身抗體型及非免疫蛋白吸附型[7]，但也有文獻報道說存在“整合假說”模式[8]。抗生素產生藥物性抗體時大多數是半抗原機制（藥物作為半抗原與紅細胞結合形成全抗原刺激機體產生藥物性抗體，其與吸附在紅細胞上的藥物抗原凝集），但也有少部分是免疫復合物機制（藥物初次進入機體時刺激機體產生藥物性抗體，藥物再次進入機體時，抗原抗體免疫復合物與紅細胞發生凝集）。由于藥物性抗體的產生機制不同，藥物包被的紅細胞法和藥物添加法的檢測原理也有所差異。兩者的不同之處在于藥物包被的紅細胞法是將藥物包被于紅細胞表面，患者血漿中的藥物誘導性抗體與紅細胞上的藥物性抗原發生凝集，而藥物添加法是將患者血漿中的藥物誘導性抗體先與藥物性抗原結合形成免疫復合物，形成的免疫復合物再去和紅細胞結合產生凝集。本文分別采用了兩種方法進行檢測，檢測結果陽性率有顯著差異，應用藥物包被的紅細胞法檢測的抗生素類藥物性抗體陽性率明顯高于藥物添加法，分析其原因可能是

臨床上大多數抗生素類藥物性抗體的產生機制為半抗原型，藥物包被的紅細胞法主要針對檢測半抗原機制所產生的藥物性抗體，而藥物添加法主要針對免疫復合物機制所產生的藥物性抗體。可見，聯合應用藥物包被的紅細胞法和藥物添加法進行藥物性抗體的檢測可提高藥物性抗體的檢測陽性率，從而減少抗生素類藥物性抗體的漏診，有助于臨床診療。

通過對12例產生抗生素類藥物性抗體陽性患者的性別、年齡以及手術治療與非手術治療分組分析，三組研究均顯示無統計學差異，故我們認為藥物性抗體陽性的產生與患者的性別、年齡及手術治療和非手術治療沒有相關性，目前國內也未見相關研究報道。

本研究共檢出頭孢類藥物性抗體陽性6例，其中第二代頭孢菌素頭孢呋辛檢出陽性4例，第三代頭孢菌素頭孢哌酮、頭孢他啶各檢出陽性1例，與文獻報道的第二代、第三代頭孢菌素是常見的造成藥物性免疫性溶血性貧血的藥物[9]相符，這可能與臨床上對第二代、第三代頭孢菌素的更廣泛應用有關。本研究統計分析發現頭孢類與非頭孢類藥物性抗體陽性率的差異有統計學意義，其中非頭孢類藥物性抗體陽性率為8.11%，頭孢類藥物性抗體陽性率為2.11%，低于山西某醫院1 595例患者頭孢類藥物性抗體陽性率3.13%[10]，且頭孢類藥物性抗體的陽性率低于非頭孢類，表明可能頭孢類藥物與其他種類藥物相比更不易產生藥物性抗體，這可能與收集標本例數少及醫院應用抗生素種類局限有關，待我們以后進一步研究探討。

表2顯示了藥物包被的紅細胞法檢測藥物性抗體陽性患者的結果，其中4號患者血漿與藥物處理紅細胞和正常紅細胞反應均為陽性結果，考慮為非藥物依賴性抗體，而1～3號，5～12號患者血漿只與藥物處理紅細胞反應為陽性結果，與正常紅細胞反應為陰性結果，考慮為藥物依賴性抗體，這表明由于抗生素的大量應用會導致機體產生抗生素類藥物性抗體，其可能與吸附藥物的紅細胞作用造成紅細胞溶解而溶血。

12例抗生素類藥物性抗體陽性患者，其中有6例患者否認有輸血史，另外6例患者近期輸注了血液制品且治療有效，所有患者均未出現溶血現象，表明這12例藥物性抗體陽性患者的貧血原因可能并非由于藥物誘導的免疫性溶血性貧血（drug-induced immune hemolytic anemia，DIHA）造成。由于陽性標本例數少，尚未進行抗生素類藥物性抗體的產生與輸血史的相關性分析，待標本量擴大再做進一步分析。雖然本研究未發現由此引起的DIHA，但國內外已有因抗生素類藥物性抗體引起的DIHA，進而引起輸血治療無效等多種不良反應的報道[3]。

綜上所述，358例臨床應用抗生素的患者中抗生素類藥物性抗體總陽性率為3.35%，其中頭孢他啶藥物性抗體陽性1例，頭孢呋辛藥物性抗體陽性4例，頭孢哌酮藥物性抗體陽性1例，哌拉西林藥物性抗體陽性1例，慶大霉素藥物性抗體陽性1例，左氧氟沙星藥物性抗體陽性1例，美羅培南藥物性抗體陽性3例。可見患者大量應用抗生素后體內可產生相應的抗生素類藥物性抗體。我國抗生素濫用的現象非常普遍，有報道我國住院患者抗生素使用率可高達74.76%[11]。抗生素的大量使用無疑會增加抗生素類藥物性抗體的產生，而一旦誤診，可能導致患者出現血管內或血管外溶血、貧血、腎衰、致死性損傷等[12]嚴重不良后果。

在我國，輸血科醫師及臨床醫師普遍對抗生素類藥物性抗體的關注度低，對于抗生素類藥物性抗體陽性的貧血患者，應及時停止相關藥物的使用，貧血仍嚴重者再考慮適時輸注紅細胞制劑。本文聯合應用兩種方法對抗生素類藥物性抗體進行檢測，大大提高了其檢出陽性率，降低了伴有貧血的抗生素類藥物性抗體陽性患者輸血治療無效事件的發生率，提高了已產生藥物性抗體的患者輸血治療效果的精準性，保障臨床輸血安全有效，節約血液資源，真正做到精準、安全、高效的血液輸注。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突