毛細管超速離心技術在體外預測大量胎母輸血綜合征的研究*

張源秦 王美茹 徐璐 馬怡然 楊融輝 郝一文 程大也 叢桂敏

胎母輸血綜合征（fetomaternal hemorrhage，FMH）是指各種不同原因所致一定量的胎兒血液通過破損的胎盤屏障或絨毛間隙進入母體血液循環，引發一系列不同程度胎兒失血、貧血及新生兒溶血病和母體溶血性輸血反應等臨床癥候群，也是非免疫性胎兒水腫的主要發病原因之一[1]。文獻報道約93%孕產婦可能發生（失血量＜0.5 mL）胎母輸血綜合征，其中失血量＞30 mL的孕婦發生率為0.3%[2]。目前國內外尚無大量胎母輸血綜合征明確的診斷標準，ALMEIDA[3]認為胎兒出血量超過80 mL就會出現嚴重的胎兒貧血，即可定義為大量胎母輸血。SAMADI[4]認為出血量超過100 mL，會發生胎兒死亡。還有作者認為胎兒向母體輸送血液超過150 mL[5]，為大量胎母輸血。圍產兒死亡率達31%～50%，約13%的死亡與FMH相關，其中約5%的死胎是大量FMH造成的，多為FMH晚期的臨床表現[6]。因此，大量胎母輸血綜合征的治療關鍵在于早發現、早診斷、早監測。目前常用診斷胎FMH的方法有：流式細胞術、酸洗脫實驗、HbF胎兒血紅蛋白測定。為了診斷和定量胎兒出血量，酸洗脫實驗（KB實驗）是最常見的篩查方式，流式細胞術是胎母輸血綜合征的診斷金標準，但這兩種方法需要配備專業的儀器和設備，價格昂貴且操作時間長需要專業人員操作，專業操作嚴格，尚未在臨床廣泛開展。因此，為了改善母嬰妊娠結局，本研究通過體外模擬胎母輸血綜合征的血標本特點，將O型非妊娠全血輸入非O型臍帶血，運用毛細管分離技術檢測胎兒紅胞A或B抗原，旨在評估毛細管超速離心技術在ABO血型不一致的大量胎母輸血的臨床檢測限及檢出率，現報道如下。

材料與方法

1 標本來源 母體模擬血液標本：采集O型育齡期非妊娠期健康女性捐獻者靜脈全血2 mL，以EDTA-K2抗凝；胎兒模擬血液標本：A和B型新生兒臍帶血，EDTA-K2抗凝。

2 試劑及儀器 抗A、B單克隆抗體（批號：20201216）為上海血液生物醫藥有限公司提供，HbF-GITC單克隆抗體（552829），為BD Biosciences公司；湘儀L550型離心機、Baso 2005-1型離心機、Diana配套孵育器及毛細管醫用超速離心機等、生物顯微鏡（CX23LEDRFS1C）、ARIA2流式儀。

3 方法

3.1 胎母輸血綜合征模擬樣本懸液的制備：取O型育齡期非妊娠健康女性捐獻者EDTA-K2抗凝血2 mL分別與8.57 μL、11.4 μL、14.2 μL、17.14 μL、28.57 μL A或B型臍帶血，按孕中后期孕婦血容量為7 000 mL（一般成人血容量在5 000 mL左右，孕中后期血液循環增加1～2 L[7]）發生了40、50、60、70、100 mL胎母輸血綜合的比例，同一個比例樣本制備重復20次，室溫下混合后孵育1小時期間并用震蕩儀使其處在混勻狀態。

3.2 胎母出血模擬樣本懸液中胎兒細胞比例的檢測：嚴格按照FITC-HbF單克隆抗體試劑說明書，以FITC標記的抗HbF抗體標記胎兒細胞，流式細胞術定量檢測胎兒細胞百分比。實驗同步以5%臍血的EDTA抗凝血分別加或不加單克隆抗體做陽性和陰性對照進行質量控制。

3.3 胎母出血模擬樣本懸液用毛細管離心技術分離胎兒細胞：按2018版AABB技術手冊[8]操作流程，將制備好模擬胎母輸血綜合征血樣本用生理鹽水洗滌三次，最后一次用1 000×g離心5 min，盡可能去掉上清后混勻。將洗滌后RBC吸出后混勻，加入1～2根比積管中，留出5 mm長度封口用。從血液加入端用橡皮泥封死管底，擠出的血液用紗布吸走。放入帶有編號的離心槽，注意平衡，擰緊內蓋，關上離心機外蓋10 000 r/min離心15～20 min。在距紅細胞柱頂（遠心端）5 mm處切開微量紅細胞比積管，此段紅細胞主要為胎兒紅細胞，見圖6～8；在距紅細胞柱底（近心端）5 mm處切開微量紅細胞比積管，此段紅細胞主要為母體新鮮紅細胞。

3.4 試管法檢測近心端、遠心端紅細胞ABO血型抗原：分別將近心端、遠心端切開的紅細胞比積管用生理鹽水洗滌三次，按照《臨床輸血技術規范》[9]進行試管法紅細胞ABO系統血型鑒定。近心端紅細胞ABO血型鑒定結果為O型，遠心端紅細胞ABO血型鑒定結果與臍帶血標本中的紅細胞血型一致時證明毛細管超速離心技術分離成功。

4 統計學處理 采用prism8.0進行作圖，運用診斷實驗性指標進行診斷試驗的分析與評價。P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 胎母輸血出血量達40 mL、50 mL、60 mL、100 mL時，流式細胞術結果如下圖1，遠心端模擬胎兒的A或B抗原的鏡下凝集圖如圖2。

圖1 模擬不同FMH出血量對應的流式圖

圖2 模擬FMH毛細血管離心后遠心端A（B）試管法鏡下凝集

2 當胎母輸血量達到60 mL時，靈敏度為0.8，特異度為0.95，符合率為0.875，約登指數為0.75最接近1，診斷價值較大。見表1。

3 ROC曲線下面積診斷價值判斷 當模擬胎母輸血為50 mL、60 mL、100 mL時，ROC曲線下面積分別為0.725、0.875、0.850，均P＜0.05，差異具有統計學意義，此時用毛細管離心技術診斷胎母輸血綜合征具有診斷價值。見表2、圖3。

圖3 毛細血管離心技術診斷不同出血量FMH的ROC曲線分析

表2 ROC曲線下面積

4 臨床病例運用 選取了兩例臨床高度懷疑發生FMH的O型產婦，用毛細管超速離心技術進行診斷，如圖4。

圖4 臨床病例毛細血管離心技術分離后遠心端結果

討 論

胎母輸血綜合征可以發生在妊娠的各個時期，孕婦早期缺乏特異性臨床表現、機體尚可代償，一旦臨床出現典型三聯征表現（胎動減少或消失、胎心監護正弦波、胎兒水腫）提示胎兒出血已經非常嚴重。大量胎母輸血綜合征是一種罕見但有時候會危及生命的事件[10]。有研究報道胎兒在母體內短期發生大量出血可導致胎動頻繁、血液大量流失，嚴重的可能發生胎兒出生后新生兒Apgar評分低、肌張力低、新生兒呼吸困難甚至窒息、胎死宮內等缺氧的臨床表現[11,12]。

目前胎母輸血綜合征的診斷方式有流式細胞術、酸洗脫實驗、胎兒血紅蛋白HbF測定等。流式細胞術是診斷的金標準，但大多數醫院缺乏相關大型檢測設備，并缺乏專業技術人員操作；酸洗脫實驗是目前最普遍的篩查方式，但假陽性和假陰性率高；胎兒HbF測定多用于科研，臨床上均難以廣泛開展。因此，想借用輸血科異體紅細胞分離的毛細管超速離心技術，該方法簡便、易操作，不需要特殊試劑和復雜的操作，即可實驗診斷大量胎母輸血綜合征。毛細管超速離心是根據受檢者新舊輸入紅細胞的比重不同進行分層的一種實驗技術[13]。毛細管直徑小、長度大，在超速離心力作用下，有密度梯度區間能進行新舊細胞的分離。FMH孕婦自體新生的紅細胞比重較小，集中在毛細管的近心端；通過破損胎盤反復輸入母體的紅細胞在老化過程中產生囊泡、膜逐漸丟失而比重不斷加大，離心后集中在毛細管遠心端[14]。

本研究通過模擬FMH發生出血的比例，在體外建立胎母輸血綜合征的模型，并嘗試用毛細管超速離心技術進行分離胎母ABO血型不一致的胎兒紅細胞。我們通過實驗發現當胎兒出血量超過50 mL時，毛細管離心技術有較大的的診斷價值（ROC曲線下面積均＞0.725），其中胎母輸血量為60 mL和100 mL時的約登指數均＞0.7，最接近于1，此時診斷價值最大。通過不同濃度梯度的FMH模擬實驗發現：當胎母輸血量越大時，特別是發生大量胎母輸血（≥50 mL）時，毛細管超速離心技術對胎母輸血綜合征的篩查價值更大。通過20例陰性的對照試驗發現，該診斷試驗的特異度為0.95，即排除了亞型和疾病原因導致的抗原減弱等出現假陰性外，誤診率較低。因此，毛細管離心技術對于ABO血型不一致的大量FMH（≥50 mL）的初篩具有較高的靈敏度和特異度。此外，毛細管超速離心技術還有操作簡便、費用低廉和創傷小等特點。

FMH診斷胎兒失血量目前國內外尚未有統一的標準，其臨床的發生概率根據胎兒失血量的不同而不同。關于大量胎母輸血綜合征的定義從30 mL到150 mL不等，有學者將大量FMH的臨界值定義為30 mL，對Rh陰性母親在生育Rh陽性胎兒時預防性使用抗D免疫球蛋白的劑量有臨床意義[15]。將出血閾值定義為80 mL和150 mL時，其FMH的發生率分別為1/1 000和1/5 000[3]。有文獻報道5%的死胎是由于大量胎母輸血造成的，通過孕期的主動監測、及時發現可疑的高危孕產可以改善圍產期孕產婦的生命安全[6]。本實驗研究的毛細管超速離心法識別胎母輸血綜合征的閾值為50 mL，可以識別出部分需要進行抗D免疫球蛋白預防的孕婦，可以識別出胎母輸血閾值定義為80 mL以上的已發生胎母輸血的孕婦，這就圍產期預防RhD免疫、減少或預防胎兒及新生兒不良預后有一定的臨床意義。

我們在實際臨床工作中發現2例用毛細管超速離心技術診斷胎母輸血綜合征的病例。病例一：喬某，25歲，G2P0，O型RhD陽性，妊娠35+5周，妊娠合并慢性高血壓，胎兒宮內窘迫，以“胎心監護異常1天”入院，完善相關檢查后次日進行剖宮產手術分娩一2 750 g活嬰，一分鐘apar評分8分，5分鐘10分。因胎兒膽紅素超正常值2倍，新生兒溶血三項試驗陽性，血型A型。病例二：孫某，30歲，G3P1，O型RhD陽性，丈夫血型為B型，妊娠30+4周，完全性前置胎盤，妊娠期糖尿病，先兆早產，因“自覺胎動減少，胎心監護異常2天” 入院。入院后期待療法，密切進行胎心監護，待胎兒成熟后擇期進行剖宮產。對這兩例產婦的血進行毛細管離心技術，分別在案例一和案例二的遠心端在反復離心后發現A細胞和B細胞鏡下凝集。

綜上所述，毛細管超速離心技術作為輸血科異體紅細胞分離的一種方法，在孕婦產前常規血型鑒定已知、排除ABO亞型及抗原表達異常的弱A弱B等情況下，若在妊娠中后期用毛細管分離發現母體存在大量ABO異型紅細胞時，可以作為大量胎母輸血綜合征的一個監測指標。文獻報道胎母出血量為30 mL的發病率為3/1 000[3]，但由于臨床對其認識不足、檢測方法受限，仍存在大量流產和胎死宮內的病例臨床未報道，FMH實際發生率可能要高于這個比例。本文是利用毛細管超速離心技術篩選胎母輸血征的實驗研究，旨在摸索一個不需要昂貴設備及試劑的簡單易行的可在臨床常規開展的實驗方法。我們在FMH的模型運用毛細管超速離心法，后期會繼續收集高危孕婦病例標本進行檢測。當然，本實驗僅完成了以O型孕產婦通過毛細管超速分離技術檢測出A或B紅細胞來篩查胎母輸血的情況。對于A型或B型孕婦與B型或A型胎兒之間的胎母輸血的篩查敏感度和特異度有待于今后進一步實驗驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突