MiR-149通過PHGDH對慢性髓系白血病細胞葡萄糖代謝的影響*

尹石紅 徐修才

慢性髓系白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）是一種以髓系細胞惡性增殖為主要特征的干細胞疾病。大約95%的CML患者由于9號和22號染色體相互易位而產生染色體異常t（9;22）（q34;q11），產生一種致癌融合蛋白，稱為BCRABL。其具有持續激活的酪氨酸激酶活性，通過異常激活下游存活信號通路PI3K（phosphatidylino sitol3 kinase）、STAT5（signal transducer and activator of transcription 5）等來轉化髓系祖細胞[1，2]。目前，CML一線治療主要依賴于酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs），其可以通過競爭性抑制ATP與ABL激酶催化中心的結合，阻斷酪氨酸激酶的活化，從而達到治療目的，具有良好的治療效果[3]。然而，在接受TKIs治療的CML患者中，仍有部分CML患者對TKIs具有原發性或繼發性耐藥，且耐藥呈多樣化和個體化特點，其具體機制尚未完全明晰[4]。

miRNA是一類長度約為22個核苷酸的小分子，近年來越來越多的研究證實miRNA參與調控慢性髓細胞白血病的發病，甚至與TKIs耐藥機制密切相關[5]。有研究發現，過表達的miR-202通過靶向己糖激酶2增強伊馬替尼耐藥的CML細胞對TKIs的敏感性，從而促進耐藥細胞凋亡[6]。同時還有研究表明異常表達的miR-149可以通過靶向調控下游JunB mRNA的表達，進而激活細胞內凋亡相關的信號通路，參與急性淋巴細胞白血病的發生發展[7]。但是miR-149在CML中的表達情況及臨床意義則報道較少。

3-磷酸甘油酸脫氫酶（3-Phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）是催化絲氨酸合成途徑的第一個關鍵酶，催化糖酵解中間產物3-磷酸甘油酸生成3-磷酸羥基丙酮酸，將糖酵解中間產物引入絲氨酸生物合成途徑（Serine synthesis pathway，SSP），控制著由糖酵解進入SSP的代謝流量[8]。研究證實，PHGDH在大腸癌、黑色素瘤等多種實體瘤中異常表達，與腫瘤的發生和增殖密切相關，并可能成為腫瘤治療的新靶點[9，10]。有文獻報道轉錄因子特化蛋白1（Specificity protein1，Sp1）是miR-149-5p的下游靶基因。Sp1是一般轉錄因子家族的成員，與腫瘤細胞的生長、凋亡密切相關，它還可以調控下游基因PHGDH的表達[11，12]。所以PHGDH可能為miR-149的下游靶點。但是在惡性血液病，包括慢性髓系白血病中的PHGDH表達情況尚不清楚。

本課題檢測了CML細胞株K562和K562G細胞中miR-149-5p及PHGDH的表達情況，同時分析細胞葡萄糖攝取量的變化。通過過表達miR-149-5p的細胞模型，進一步探討miR-149-5p相關通路與CML細胞糖酵解活性，以及伊馬替尼耐藥產生的相關性，為CML的臨床治療提供新的研究方向。

技術與方法

1 試劑與儀器 IMDM培養基（Gibco，美國），胎牛血清（FBS）（ Gibco，美國），伊馬替尼（大連美侖生物，中國），CCK-8細胞增殖試劑盒（同仁公司，日本），葡萄糖檢測試劑盒（Abbkine，美國），SpectraMAX i3x酶標儀（MolecuLar Devices，美國），qRT-PCR試劑盒（TaKaRa生物公司，日本），慢病毒試劑（上海吉凱基因，中國），miR-149、U6引物（上海吉瑪，中國），PHGDH、GAPDH引物（合肥俊安生物，中國），PHGDH抗體（Cell Signaling Technology （CST），美國），GAPDH抗體（proteintech，美國）。細胞培養箱（37 ℃、5%CO2）（Thermo Scientific，美國），逆轉錄儀器Gene Amp PCR system 9700（Thermo Scientific，美國），熒光定量PCR儀（ABI 7500，美國），FUSION-FX5凝膠成像系統（VILBER LOURMAT，法國）。

2 構建伊馬替尼耐藥的CML細胞株 K562G人來源的慢性髓系白血病細胞株K562從上海生命科學研究所獲得。K562細胞用含1%青霉素鏈霉素和10%FBS的IMDM培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。采用濃度梯度誘導法構建伊馬替尼耐藥的細胞株K562G，從0.1 μmol/L伊馬替尼開始，每3天傳代一次，濃度每6天增加0.2 μmol/L，直至增加至5 μmol/L后，保持并傳代3次，CCK8實驗鑒定耐藥倍數。

3 CCK8實驗檢測K562和K562G細胞的IC50 取對數生長期的K562和K562G細胞，150×g離心5 min，棄去上清，用含10%FBS的IMDM培養基重懸細胞，按1×104個/孔的密度調整細胞數接種于96孔板，每孔總體積100 μL。5個實驗分組如下：空白組（IMDM培養基）、K562對照組（細胞懸液）、K562G對照組（細胞懸液），K562+IM處理組（IM濃度為3 μmol/L，2.5 μmol/L，1.5 μmol/L，1 μmol/L，0.5 μmol/L）、K562G+IM處理組（IM濃度為200 μmol/L，150 μmol/L，100 μmol/L，50 μmol/L，10 μmol/L），以上每組設5個復孔，均培養24 h后，K562+IM處理組及K562G+IM處理組每孔加入相應濃度的IM試劑10 μL，培養24 h后，每孔再加入CCK8試劑10 μL，37 ℃培養箱孵育1.5 h，于酶標儀上測定450 nm波長吸光度值。IC50（K562G）/IC50 （K562）在20倍以上才可以進行后續實驗。

4 慢病毒轉染實驗 采用耐藥伊馬替尼的K562G細胞株進行mir-149-5p的慢病毒過表達包裝，具體操作步驟如下：約1×105個細胞加200 μL的IMDM完全培養基鋪于48孔板，放于37 ℃和5%CO2的培養箱中培養過夜。次日顯微鏡下觀察細胞密度，約為30%～40%（感染時細胞數約為2×105個細胞/孔）左右可以進行下一步實驗。從冰箱取出慢病毒OE（過表達）和NC（陰性對照）置于冰上融化。預實驗發現病毒感染MOI值為80的時候感染效率最佳，OE組每孔加入16 μL病毒用量，NC組加入20 μL病毒用量，并加IMDM完全培養基補足至200 μL。感染后16 h可換液一次。一般感染后72 h于熒光顯微鏡下觀察GFP熒光。感染效率=熒光蛋白表達的細胞數/同一視野明場總細胞數×100%。慢病毒感染72 h后，傳代1次，可向培養基中加入嘌呤霉素用于篩選帶GFP熒光的目的細胞株，嘌呤霉素的工作濃度為2 μg/mL時最佳。后期可用qRT-PCR實驗方法檢測mir-149-5p的表達情況。

5 RT-qPCR 根據TAKARA-RR036A試劑盒的操作說明進行逆轉錄實驗，取400 ng總RNA加入5×PrimeScript RT Master Mix試劑2 μL，補足無Rnase水至反應總體積10 μL。逆轉反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃冷卻保存。根據TAKARARR820A熒光定量PCR試劑盒的說明進行基因擴增。按照說明書取2 μL的逆轉錄產物，分別加入Taq酶10 μL，引物1.6 μL，ROX染料0.4 μL，補足無Rnase水至反應總體積20 μL，進行PCR反應。擴增條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，共進行40個循環。引物序列如下（見表1）。

表1 用于實時熒光定量PCR反應的引物

6 Western blot實驗 取約1×106個目的細胞，150×g離心5 min，棄去上清加入RIPA裂解液及PMSF和磷酸酶抑制混合液，充分混勻后將蛋白質樣品放在冰盒中，搖床上劇烈搖晃30 min，4 ℃ 1500×g離心15 min后，取上清至新的EP管中。按照說明書用BCA法測蛋白濃度，剩下的蛋白樣品加入5×SDS上樣緩沖液充分混勻，100 ℃加熱15 min后將蛋白拿出，保存至-80 ℃冰箱中。取50 μg蛋白質樣品進行10% SDSPAGE 電泳，100 V 90 min轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶室溫封閉1 h，分別加入一抗PHGDH抗體1∶1 000（Cell Signaling Technology，美國），GAPDH抗體1∶20 000（proteintech，美國）。4 ℃搖床過夜。TBST室溫洗3次，每次10 min。加入相應的由HRP標記的二抗1∶50 000（Abbkine，美國），室溫孵育1 h，TBST 洗3次，每次10 min，ECL化學發光顯色系統顯色。GAPDH作為內參。

7 檢測K562、K562G、149G和149N細胞葡萄糖攝取量。

7.1 樣本制備：取對數生長期的149G、149N細胞（約1×106個細胞），用預冷PBS洗滌細胞。500×g離心3 min，棄去PBS。分別加入200 μL預冷PBS，進行超聲波破碎1 min（冰浴，強度20%或200 W，超聲2 s，停1 s） ，使細胞迅速勻漿。4 ℃，12 000×g離心5 min，收集上清液并轉移到新的EP管中。

7.2 標準品制備：將300 mg/dL Glucose標準品按說明書稀釋為300、200、100、50、20、10、4、0 mg/dL，并計算出標準品線性回歸方程。

7.3 步驟：將25 μL稀釋標準品和樣品轉移到適當標記的試管中，每管加入500 μL鄰甲苯胺試劑。置于金屬加熱槽100 ℃加熱8 min后，在冷水浴中冷卻4 min。將200 μL一式兩份轉移到透明的底部96孔板中，讀取630 nm吸光度，最后根據公式計算出細胞樣品的葡萄糖攝取量濃度。每次至少2個復孔，至少進行3次生物學重復實驗。

8 LC-MS/MS樣本制備 取對數生長期的K562及K562G細胞約1×107/mL，800×g離心10 min收集細胞，棄上清。用預冷的PBS洗滌2次，置于冰上，棄上清。液氮速凍2 h，-80 ℃凍存備用。每組各6個細胞和1個QC樣品。樣本分別加入1 mL甲醇/乙腈/水（2∶2∶1，v/v/v），渦旋混勻，冰浴中超聲20 min，-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白，14 000 rcf 4 ℃離心20 min，取上清，真空干燥。質譜檢測時加入100 μL乙腈-水溶液（1∶1，v/v）復溶，14 000 rcf 4 ℃離心20 min，取上清進樣分析。

9 統計學處理 使用GraphPad Prism 7.0進行作圖，細胞系實驗數據經過SPSS17.0處理，兩樣本的比較采用獨立樣本的t檢驗分析，P＜0.05被認為具有統計學意義。

結 果

1 伊馬替尼耐藥的CML細胞株K562G中miR-149-5p的表達明顯低于伊馬替尼敏感的CML細胞株K562 通過CCK8實驗檢測出K562細胞株IC50為0.28 μmol/L（見圖1A），K562G細胞株的IC50是14.6 μmol/L（見圖1B），K562G細胞與K562細胞株的IC50比值為52，IM耐藥的CML細胞株構建成功。miRNA芯片結果提示，K562和K562G細胞中mir-149-5p的表達存在明顯差異（見圖1C）。運用qRT-PCR方法檢測K562和K562G細胞株中mir-149-5p的表達（見圖1D）。

圖1 CML細胞miRNA-149-5p的表達情況

2 K562和K562G，149G和149N細胞中葡萄糖攝取量的表達 IM耐藥的K562G細胞株與IM敏感的K562細胞相比，葡萄糖攝取量明顯升高（見圖2A）。與149N細胞相比，149G細胞葡萄糖攝取量明顯降低（見圖2B）。

圖2 不同CML細胞中葡萄糖攝取量

3 PHGDH是miR-149-5p的下游靶點 為了進一步研究mir-149-5p在CML中的作用，通過慢病毒轉染技術在IM耐藥的K562G細胞中過表達mir-149-5p，運用qRT-PCR檢測149G細胞株中miR-149-5p的感染效率，結果顯示149G細胞比149N細胞高表達miR-149-5p（見圖3A）。運用qRT-PCR和WB實驗，我們發現與IM敏感的K562細胞相比，PHGDH在IM耐藥的K562G細胞中高表達。而149G細胞比149N細胞低表達PHGDH（見圖3B&C）。miR-149-5p與PHGDH表達呈負相關。

圖3 PHGDH在CML細胞中的表達情況

4 基于LC-MS/MS技術對慢性髓系白血病細胞進行靶向代謝組學分析 為了進一步研究CML中miR-149相關通路與糖酵解活性的聯系，我們通過LCMS/MS技術對K562細胞及K562G細胞進行三羧酸循環、糖酵解途徑和氧化磷酸化過程中的30個重要代謝物靶向代謝組學分析，結果發現IM敏感的K562細胞株與IM耐藥的K562G相比有9種代謝物表現出差異（*P＜0.05）（見圖4A）。如Fumarate （延胡索酸），L-Malic acid（蘋果酸），Succinate（琥珀酸），Oxaloacetate（草酰乙酸），NADH（還原型輔酶Ⅰ），Flavin mononucleotide（黃素單核苷酸，FMN），cAMP（環磷酸腺苷），NADP（氧化型輔酶Ⅱ）在K562細胞株中升高更為明顯，而Dihydroxyacetone phosphate（磷酸二羥丙酮）在K562G細胞株中升高更為顯著。進一步分析數據發現這9種差異性代謝物主要涉及Tricarboxylic acid cycle（三羧酸循環）、Pyruvate metabolism（丙酮酸代謝）、Alanine，aspartate and glutamate metabolism（丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝）、Glycolysis /Gluconeogenesis（糖酵解/糖異生）、Glyoxylate and dicarboxylate metabolism（二羧酸代謝）、Tyrosine metabolism（酪氨酸代謝） （見圖4B）。

圖4 CML細胞代謝組學分析

討 論

目前CML的治療藥物主要是酪氨酸激酶抑制劑TKIs，如第一代TKIs伊馬替尼等。雖然一些CML患者在服用伊馬替尼等藥物治療后能夠達到完全細胞遺傳學緩解，但是仍有部分患者不能耐受伊馬替尼藥物毒性或者對伊馬替尼產生耐藥而必須更換其他藥物[13，14]。近年來有研究表明[15]，糖酵解的失衡可能利于腫瘤進展及耐藥性產生，主要是源于原癌基因直接導致的代謝重編程，滿足了腫瘤細胞的高合成代謝所需。這種代謝模式改變不僅見于實體瘤，也同樣見于惡性血液病。

本研究首次發現IM耐藥的K562G細胞中miR-149-5p的表達明顯低于IM敏感的K562細胞。同時，K562G細胞較K562細胞高表達PHGDH及葡萄糖攝取量。但是通過進一步在IM耐藥的K562G細胞株中過表達mir-149-5p后，發現149G細胞中的葡萄糖攝取量和PHGDH表達明顯降低。提示IM耐藥的CML細胞與葡萄糖代謝和PHGDH的高度表達密切相關，而miR-149可以負向調控其表達。為了進一步探究CML中miR-149相關通路的代謝特征，我們通過LC-MS/MS技術進一步對K562和K562G細胞進行代謝組學分析，結果發現Dihydroxyacetone phosphate（磷酸二羥丙酮）在IM耐藥的K562G細胞中高度表達。而磷酸二羥丙酮是糖酵解途徑的代謝產物，由1，6-二磷酸果糖在醛縮酶的作用下形成，可以通過磷酸丙糖異構酶的作用和3-磷酸甘油醛相互轉化而進入糖酵解途徑，也可以被還原為3-磷酸甘油，其主要涉及α-磷酸甘油穿梭機制。當IM敏感的CML細胞胞液中NADH濃度升高時，胞液中的磷酸二羥丙酮首先被NADH還原成3-磷酸甘油（α-磷酸甘油），反應是由細胞質的NAD有關的α-磷酸甘油脫氫酶所催化生成的。所以，CML細胞中磷酸二羥丙酮的表達與其NADH的表達呈負相關，可能與CML細胞IM耐藥機制密切相關，為CML疾病判定療效及預后的提供了新的研究方向。

以上實驗結果表示miR-149-5p靶向PHGDH相關通路參與調控CML細胞伊馬替尼耐藥和葡萄糖代謝。過表達的miR-149可能通過降低CML細胞的高糖酵解活性，抑制CML細胞增殖，增加其對伊馬替尼的敏感性促進細胞凋亡。所以，糖酵解抑制劑聯合TKIs可能對CML耐藥細胞展現出化療增敏作用，使CML細胞因能量供應缺乏而死亡。其機制可能涉及三羧酸循環、丙酮酸代謝、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、糖酵解/糖異生、二羧酸代謝、酪氨酸代謝等通路，這為研究CML耐藥機制提供了新的方向。但miR-149-5p與PHGDH之間的具體調控機制尚未明確，這需要我們未來去進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突