水飛薊賓及其衍生物生物活性及作用機(jī)制的研究進(jìn)展

張志鵬，孟艷秋*，王 趲

1.沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 100142

2.沈陽(yáng)化工大學(xué) 分析測(cè)試中心，遼寧 沈陽(yáng) 100142

水飛薊賓屬于黃酮木脂素類(lèi)化合物，從水飛薊Silybum marianum(L.)Gaertn.的種子中提取分離得到。水飛薊賓由2 種非對(duì)映異構(gòu)體水飛薊賓A（2R,3R,10R,11R）和水飛薊賓B（2R,3R,10S,11S）等比例混合組成[1]，具有多種生物活性，尤為突出的是保護(hù)肝臟和清除自由基的作用。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓對(duì)非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）的療效已有臨床驗(yàn)證。水飛薊賓治療前列腺癌已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[2]。此外，水飛薊賓對(duì)糖尿病也具有一定的治療作用。本文主要對(duì)水飛薊賓及其衍生物的生物活性及作用機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 護(hù)肝作用

1.1 水飛薊賓治療NASH

馬來(lái)西亞隆坡醫(yī)院開(kāi)展了水飛薊賓治療NASH的臨床試驗(yàn)，結(jié)果表明，試驗(yàn)效果理想[3]，但沒(méi)有明確作用機(jī)制。

1.1.1 抗炎與抗氧化作用 水飛薊賓對(duì)NASH的治療作用依賴(lài)于抗氧化與抗炎作用相互協(xié)同。在雙酚A 誘導(dǎo)類(lèi)固醇激素代謝導(dǎo)致的細(xì)胞增殖NASH 模型中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）與磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路被激活，導(dǎo)致肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激與炎癥損傷，水飛薊賓能夠抑制這一過(guò)程，并同時(shí)激活半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine proteinase-3，Caspase-3）促進(jìn)增殖細(xì)胞凋亡[4]。核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）是一條經(jīng)典的炎癥通路，水飛薊賓抑制O-N-乙酰葡糖胺糖基化（glycosylation ofON-acetylglucosamine，O-GlcNAcylation）可降低NFκB 及其下游的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的過(guò)度表達(dá)，減輕NASH 炎癥反應(yīng)，從而改善肝臟功能[5]。此外，在棕櫚酸酯誘導(dǎo)的小鼠NASH模型中，較小劑量的水飛薊賓即可恢復(fù)由棕櫚酸酯引起的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）水平降低，從而激活2型去乙酰化酶（sirtuin type 2，SIRT2）通路并調(diào)控其下游蛋白，最終抑制IL-1β 炎性因子的產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應(yīng)[6]。水飛薊賓也可通過(guò)抑制聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶（poly adenosine diphosphateribose polymerase，PARP）的激活，恢復(fù)NAD+水平，增加SIRT1 與腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）的表達(dá)與活性對(duì)抗炎癥治療NASH[7]。

水飛薊賓對(duì)氧化應(yīng)激與炎癥的抑制作用極大程度地依賴(lài)于降低組織活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平實(shí)現(xiàn)。Ou 等[8]研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓通過(guò)激活核因子相關(guān)因子 2（nuclear factorerythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路，可直接降低ROS 水平，減輕ROS 對(duì)肝臟的氧化損傷。另一方面，游離脂肪酸氧化可導(dǎo)致ROS 和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）增加，并導(dǎo)致炎癥通路被激活，水飛薊賓作為天然抗氧化劑能降低ROS 水平，進(jìn)而抑制下游的NF-κB（p50/p65 亞型）與p65 下游的iNOS 表達(dá)與活性，從而對(duì)抗炎癥[9]。

1.1.2 調(diào)節(jié)脂代謝 水飛薊賓可在一定程度上抑制膽固醇代謝酶CYP27A1 活性和核轉(zhuǎn)錄因子法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatorsactivated receptors γ，PPARγ）、肝臟X 受體（liver X receptor，LXR）表達(dá)，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（6-phosphate glucose dehydrogenase，G6PD）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP4）、脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase，LPL）、分化簇36（cluster of differentiation 36，CD36）水平，從而抑制脂肪酸生成，最終降低三酰甘油（triglyceride，TG）水平[10]。硬脂酰輔酶A 去飽和酶-1（stearyl coenzyme A dehydrogenase-1，SCD-1）是一種將飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）轉(zhuǎn)化為單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）的酶，水飛薊賓可顯著增強(qiáng)（甚至明顯高于對(duì)照組）SCD-1 的表達(dá)與活性，調(diào)節(jié)脂代謝，緩解NASH[9]。

在脂質(zhì)代謝方面，上調(diào)PPARα、PPARδ水平可促進(jìn)脂質(zhì)分解，脂肪酸引起的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（sterol regulatory element-binding protein-1，SREBP-1）過(guò)表達(dá)可被水飛薊賓逆轉(zhuǎn)，使得其下游的脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）被降低至正常水平，且負(fù)責(zé)調(diào)控脂肪代謝的肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A（recombinant carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A）表達(dá)水平提高，這一機(jī)制也被認(rèn)為是水飛薊賓減輕肝臟脂質(zhì)堆積與過(guò)氧化的主要途徑[7]。此外，在多種NASH 動(dòng)物模型中，水飛薊賓能激活c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），調(diào)控其下游代謝，同時(shí)，下調(diào)PI3K-Akt 增加2-[N-(7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑-4-氨基]-2-脫氧-D-葡萄糖[2-[N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose，2-NBDG]的攝取，在一定程度上改善脂質(zhì)/膽固醇在肝臟的堆積從而對(duì)抗NASH[11]。

1.1.3 改善線(xiàn)粒體功能 在NASH模型中可明顯觀察到線(xiàn)粒體形態(tài)與功能的改變，水飛薊賓可增加線(xiàn)粒體體積，改善線(xiàn)粒體嵴功能，增加細(xì)胞線(xiàn)粒體CPT-1 與微粒體CYP2E1 的表達(dá)，對(duì)抗脂肪酸誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體損傷與脂肪酸依賴(lài)性脂質(zhì)過(guò)氧化（降低丙二醛水平）及DNA 氧化損傷[提高脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（apurinic-apyrimidinicendonuclease 1，APE1）和DNA 指導(dǎo)聚合酶（recombinant polymerase DNA directed gamma，Polg）的表達(dá)]，并增加過(guò)氧化氫酶活性，極大程度地恢復(fù)線(xiàn)粒體功能[12]。水飛薊賓通過(guò)作用線(xiàn)粒體功能蛋白極長(zhǎng)鏈酰基輔酶A脫氫酶（very long-chain acyl-CoA dehydrogenase，VLCAD）及解偶聯(lián)蛋白 2（uncouplingprotein 2，UCP2），抑制環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）活性，同時(shí)，上調(diào)脂代謝調(diào)控因子miR-122 表達(dá)水平，進(jìn)而增加了水通道蛋白 9（aquaporin protein-9 polypeptide，AQP9）的表達(dá)與甘油通透性，從而增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)外的脂質(zhì)交流緩解細(xì)胞脂質(zhì)負(fù)擔(dān)，且有報(bào)道提示，AQP9 可能是水飛薊賓治療NASH 的新型靶標(biāo)[13]。

上述研究表明，在NASH 疾病發(fā)展過(guò)程中，水飛薊賓主要通過(guò)ROS 和PPARα、δ、γ 抑制炎癥反應(yīng)與脂代謝紊亂，緩解甚至逆轉(zhuǎn)NASH 病程發(fā)展（圖1），為臨床上應(yīng)用水飛薊賓治療NASH 提供理論基礎(chǔ)。

圖1 水飛薊賓治療NASH 的機(jī)制Fig.1 Mechanism of silybin in treatment of NASH

1.2 水飛薊賓治療肝炎

水飛薊賓臨床上目前被用于解救蘑菇中毒與治療急慢性肝病[14]。近年來(lái)，對(duì)水飛薊賓護(hù)肝作用有了更深入的研究。在硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝炎模型中，水飛薊賓可抑制NF-κB 通路，使血清TNFα、IL-6 水平降低，并可逆轉(zhuǎn)硫代乙酰胺誘導(dǎo)的丙二醛水平升高，但對(duì)肝臟還原型谷胱甘肽無(wú)明顯影響，這表明水飛薊賓的治療肝炎作用主要通過(guò)抗炎而不是抗氧化過(guò)程。

1.3 水飛薊賓抗肝纖維化

肝炎可能繼續(xù)發(fā)展形成肝纖維化，導(dǎo)致肝臟進(jìn)一步損傷。在大鼠肝纖維化模型中，水飛薊賓100 mg/kg可顯著下調(diào)肝組織中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血清堿性磷酸酶水平，激活超氧化物歧化酶與過(guò)氧化氫酶活性、逆轉(zhuǎn)三磷酸腺苷酶活性下降與羥脯氨酸和膠原蛋白水平的升高，提示水飛薊賓具有保肝與抗纖維化的作用[15]。血小板活化因子是一種廣泛的炎性因子，可引起肝硬化及纖維化，溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶（lysophosphatidylcholine，LPCAT）在血小板活化因子重構(gòu)過(guò)程中扮演重要角色，水飛薊賓可激活肝硬化大鼠LPCAT1與LPCAT2的活性與表達(dá)，緩解血小板活化因子對(duì)肝臟的損傷從而抑制肝纖維化[16]。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2/9（matrix metalloproteinase-2/9，MMP-2/9）作為一種參與膠原降解的主要蛋白酶，在NASH 肝炎向肝纖維化發(fā)展過(guò)程中同樣具有關(guān)鍵作用，在游離脂肪酸誘導(dǎo)的NASH 肝癌Huh7 細(xì)胞中，水飛薊賓可上調(diào)MMP-2/9 的表達(dá)并恢復(fù)其生物活性[17]。這2 項(xiàng)研究提示LPCAT 或MMP-2/9 可能是水飛薊賓治療肝纖維化的重要靶點(diǎn)。

1.4 水飛薊賓衍生物的抗氧化作用

2,3-脫氫水飛薊賓（2,3-dehydrosilybin，DHS）是水飛薊賓抗氧化衍生物中最具代表性的化合物之一。在2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，PDDH）法抗氧化實(shí)驗(yàn)中，DHS 對(duì)自由基的清除能力是水飛薊賓的25 倍[18]，根據(jù)密度泛函原理，DHS 結(jié)構(gòu)中擴(kuò)大的電子共軛體系使其成為更好的電子供體對(duì)抗自由基[19]。在四氯化碳誘導(dǎo)異型組蛋白（DNA 損傷標(biāo)志物）水平升高的大鼠肝細(xì)胞損傷模型中，DHS 可通過(guò)部分降低ROS 水平與活性抑制脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)DNA 造成的損傷，并且降低血清中TNF-a、IL-6、γ 干擾素、一氧化氮（nitric oxide，NO）和iNOS 的表達(dá)水平，提示DHS作為較水飛薊賓更強(qiáng)的抗氧化劑同樣可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)對(duì)抗肝損傷[20]。

水飛薊賓衍生物1～7、10、11（圖2）可能作為更好的抗氧化劑對(duì)抗肝臟或其他組織的氧化應(yīng)激損傷[21-26]。Gazák 等[27]在采用PDDH 法對(duì)水飛薊賓中羥基抗氧化作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，C-20-OH 是抗氧化、清除自由基的必須基團(tuán)，C-7-OH 的存在會(huì)降低水飛薊賓的抗氧化能力。其他研究顯示，對(duì)C-20-OH 進(jìn)行修飾，如衍生物2、3、5，在大鼠肝臟勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出較水飛薊賓更好的抗氧化活性，這可能是由于抗氧化測(cè)定方式不同造成的系統(tǒng)差異。

圖2 水飛薊賓衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of silybin derivatives

2 抗腫瘤作用

2.1 水飛薊賓抗腫瘤作用機(jī)制

水飛薊賓的抗腫瘤機(jī)制復(fù)雜（表1），其中通過(guò)增加腫瘤細(xì)胞ROS 水平，使癌細(xì)胞發(fā)生快速氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡是水飛薊賓最主要的抗腫瘤機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓誘導(dǎo)ROS 水平的升高與細(xì)胞內(nèi)鈣離子蓄積有關(guān)，大量鈣離子可能影響線(xiàn)粒體功能導(dǎo)致ROS 的過(guò)量釋放，因?yàn)榧?xì)胞外鈣離子螯合劑可阻斷水飛薊賓誘導(dǎo)的ROS 水平增加[37]。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓增加胰腺癌細(xì)胞線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素C 水平，進(jìn)而誘導(dǎo)ROS 的產(chǎn)生，致使細(xì)胞發(fā)生快速氧化應(yīng)激死亡[38]。Zheng 等[39]在乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大劑量（200～300 μmol/L）水飛薊賓誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過(guò)程存在2 種相互沖突的機(jī)制：一方面水飛薊賓可通過(guò)下調(diào)雌激素受體α 表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞自噬凋亡；另一方面水飛薊賓誘導(dǎo)的ROS 上調(diào)可對(duì)抗自噬過(guò)程。早在2012年，Yu 等[40]在人表皮樣癌A431細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)水飛薊賓200～500 μmol/L 作用24 h/48 h可降低細(xì)胞ROS 水平，在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡過(guò)程中發(fā)面水飛薊賓充當(dāng)了抗氧化劑角色通過(guò)降低線(xiàn)粒體現(xiàn)，線(xiàn)粒體膜電位下降導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙，一方呼吸作用與增加谷胱甘肽的表達(dá)降低了ROS 水平；另一方面水飛薊賓增加了細(xì)胞內(nèi)NO 水平，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬與凋亡。這些研究表明，水飛薊賓在抗腫瘤過(guò)程中對(duì)ROS 的影響具有“雙刃劍”的作用，這一現(xiàn)象的發(fā)生可能具有細(xì)胞差異性，但是否存在劑量差異性還未得到證實(shí)。

表1 水飛薊賓在不同癌細(xì)胞中的分子靶點(diǎn)/通路Table 1 Molecular targets/pathways of silybin in different cancer cells

2.2 水飛薊賓衍生物的抗腫瘤作用

近年來(lái)，水飛薊賓衍生物的抗腫瘤作用也受到廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)多種水飛薊賓衍生物（8、9、12～15，圖2），表現(xiàn)出較水飛薊賓更強(qiáng)的抗腫瘤活性，見(jiàn)表2。

表2 水飛薊賓衍生物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的抑制活性Table 2 Inhibitory activity of silybin derivatives on different cancer cells

關(guān)于水飛薊賓衍生物抗腫瘤活性提高的原因，認(rèn)為可能與衍生物結(jié)構(gòu)中引入了烷基等脂溶性基團(tuán)導(dǎo)致化合物脂溶性增加有關(guān)。遺憾的是國(guó)內(nèi)外對(duì)衍生物抗腫瘤機(jī)制的研究還未展開(kāi)。

3 治療糖尿病

3.1 降低血糖

胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是一種腸道L 細(xì)胞分泌的腸促胰素，激動(dòng)GLP-1 受體（GLP-1 receptor，GLP-1R），具有降低血糖、保護(hù)胰島β 細(xì)胞等作用，但內(nèi)源性GLP-1 或人工合成類(lèi)肽半衰期極短。水飛薊賓能增加十二指腸GLP-1R 數(shù)量的表達(dá)，降低肝臟葡萄糖的產(chǎn)生，從而有效降低血糖[44]。此外，水飛薊賓與DHS 均可通過(guò)直接與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporters，GLUT）相互作用抑制細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取，該作用為水飛薊賓或DHS 的葡萄糖饑餓療法抗腫瘤提供了理論基礎(chǔ)，并提示水飛薊賓及DHS 可能作用于腸道GLUT 抑制葡萄糖吸收治療糖尿病[45]。

3.2 保護(hù)靶器官

水飛薊賓可保護(hù)雌激素受體，增強(qiáng)雌激素受體的表達(dá)與激活，并通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬與抑制凋亡途徑保護(hù)胰島細(xì)胞免受TNF-α 與IL-1β 所致的細(xì)胞損傷[46]，還可保護(hù)胰腺β 細(xì)胞免受由胰淀素與β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS 和RNS 對(duì)細(xì)胞造成的損傷[47]，同時(shí)促進(jìn)SIRT-1 表達(dá)，生理性恢復(fù)自噬，逆轉(zhuǎn)高血糖，修復(fù)受損胰腺β 細(xì)胞[48]，因此水飛薊賓在胰腺保護(hù)過(guò)程中，可能具有積極作用。此外，水飛薊賓通過(guò)上調(diào)胰島素誘導(dǎo)基因1（insulin induced gene，Insig-1），進(jìn)而抑制SREBP-1c 的表達(dá)，調(diào)控下游一系列信號(hào)通路，可改善胰島β 細(xì)胞功能障礙，阻斷細(xì)胞凋亡恢復(fù)細(xì)胞活力，促進(jìn)胰島素分泌并抑制脂質(zhì)合成[49]。由鏈脲佐菌素介導(dǎo)的糖尿病大鼠DNA損傷情況在水飛薊賓治療組中被明顯改善，這得益于水飛薊賓優(yōu)良的抗氧化活性尤其是對(duì)羥基自由基的高反應(yīng)性，這能保護(hù)DNA 免受ROS 損傷，一定程度上解釋了水飛薊賓恢復(fù)胰島素分泌的機(jī)制[50]。

3.3 治療糖尿病并發(fā)癥

高糖環(huán)境對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是糖尿病的主要并發(fā)癥，不對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸是NOS 的內(nèi)源性抑制劑，水飛薊賓通過(guò)降低血管內(nèi)不對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸水平，顯著改善糖尿病小鼠內(nèi)皮功能障礙[51]。此外，單獨(dú)使用水飛薊賓即可恢復(fù)還原型谷胱甘肽與抗氧化酶活性，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[52]。另一方面，糖尿病可引起腎臟慢性病變甚至纖維化，水飛薊賓通過(guò)激活A(yù)kt 信號(hào)通路，降低糖原合成酶激酶-3β、細(xì)胞凋亡因子與Caspase-3 水平，保護(hù)腎臟免受高糖誘導(dǎo)的損傷，而在腎纖維化過(guò)程中，水飛薊賓降低了以I型膠原、纖維連接蛋白及α 平滑肌肌動(dòng)蛋白為代表的纖維化標(biāo)志物，并下調(diào)NF-κB 表達(dá)水平抑制糖尿病腎病及纖維化[53-54]。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

水飛薊賓對(duì)多種疾病表現(xiàn)出良好的治療效果，由于其抗炎、抗纖維化與穩(wěn)定細(xì)胞膜作用機(jī)制的清晰，水飛薊賓臨床治療適應(yīng)癥可能進(jìn)一步擴(kuò)大。在抗腫瘤方面，水飛薊賓天然的低毒性?xún)?yōu)勢(shì)，具有極大的發(fā)展?jié)摿?，但?duì)其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。水飛薊賓的抗糖尿病活性也是目前的研究熱點(diǎn)之一。對(duì)水飛薊賓研究的難點(diǎn)是如何高效的分離水飛薊賓非對(duì)映異構(gòu)體，這對(duì)于研究水飛薊賓A、B 的生物活性及確定異構(gòu)體中有效的分子構(gòu)象至關(guān)重要。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突