金線蓮UGPase基因克隆與表達及在多糖合成中的作用

嵇元燁，吳 梅，吳秋麗，江晴兒，謝曉鴻*，孔向軍*，王忠華*

1.浙江萬里學院生物技術研究所，浙江 寧波 315100

2.金華市匠康金草生態農業科技科技有限公司，浙江 金華 321007

金線蓮Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.是蘭科開唇蘭屬植物，是名貴的中草藥，其全草入藥，具有清熱涼血、除濕解毒的功效，可治療肺結核咯血、糖尿病、腎炎、膀胱炎、重癥肌無力、遺精、風濕性及類風濕性關節炎、小兒驚風、婦女白帶以及毒蛇咬傷等癥[1]。研究表明，多糖是金線蓮主要的藥用活性成分之一，金線蓮多糖具有降血糖[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、保肝[5]、免疫調節[6]等生物活性。

在植物糖代謝途徑中，UGPase基因主要催化尿苷三磷酸和葡萄糖-1-磷酸，形成尿苷二磷酸葡萄糖和PPi（Glucose 1-phosphate+UTP?PPi＋UDPG），這是一個依賴Mg2+的可逆反應，其反應產物UDPG可以參與植物中蔗糖合成，纖維素合成以及淀粉合成等，并為植物細胞壁合成提供前體物質[7]，同時UGPase 是合成植物多糖的關鍵酶[8]。目前，已從馬鈴薯Solanum tuberosumL.[9]、大麥Hordeum vulgareL.[10]、小果野蕉Musa acuminataColla[11]、水稻Oryza sativaL.[12]、香瓜Cucumis meloL.[13]、棉花Gossypium hirsutumL.[14]、小麥Triticum aestivumL.[15]等植物中分離出UGPase基因。目前國內外關于金線蓮多糖合成途徑中的關鍵基因的報道較少，而UGPase基因在金線蓮多糖合成代謝途徑中的調控作用尚未明確。本研究采用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技術和RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技術，首次從金線蓮中克隆出UGPase基因全長，并用生物信息學手段對該序列進行分析驗證。同時分析了其在7 個金線蓮品種中組培期與種植期莖段中的表達量、酶活與多糖含量的相關性。為深入研究UGPase基因在金線蓮多糖合成途徑中的分子調控作用和通過基因工程手段特異性調控關鍵酶基因從而促進代謝產物大量合成積累提供基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料收集與處理

本研究以由2019年下半年同批的7 個不同品種金線蓮（尖葉、小葉、圓葉、健君、無紋、匠康1 號、匠康2 號）的組培苗以及種植苗的莖段為材料，具體差異見圖1。其中組培苗采自2019年11月，組培時間3 個月；種植苗采自2020年5月，經煉苗后種植時間6 個月，材料收集自金華市農業科學研究院，經浙江萬里學院生物與環境學院王忠華教授鑒定為蘭科開唇蘭屬植物金線蓮A.roxburghii(Wall.)Lindl.的莖段部位。新鮮材料經過清水沖洗后，用酒精擦拭及DEPC 處理水洗滌后，放入液氮中速凍，然后置于-80 ℃冰箱中保存備用。

圖1 不同品種金線蓮樣品差異Fig.1 Samples differences in different varieties of Anoectochilus roxburghii

1.2 儀器

MastercyclerproS 梯度PCR 儀、5430R 低溫高速離心機、微量移液器（Eppendorf 公司）；GelDocXR+凝膠成像儀、CFX96實時熒光定量PCR（Bio-RAD公司）；NanoDropTM2000 分光光度計（Thermo Fisher Scientific公司）；蒸汽高壓滅菌鍋（SANYO 公司）；超低溫冰箱（New Brunswick）；電子分析天平（Mettler Toledo 公司）；電泳儀（北京六一生物科技公司）；紫外分光光度計（上海天能科技有限公司）；恒溫金屬浴（上海生工有限公司）；冷凍恒溫搖床（上海智城有限公司）；智能生化培養箱（寧波江南儀器廠）。

2 方法

2.1 總RNA 提取、cDNA 第1 鏈的合成及RACE cDNA 的合成

以尖葉金線蓮組培苗莖段為材料，按北京金線蓮莖段的總RNA。采用NanoDropTM 2000 分光光度計（Thermo Fisher，美國）測定總RNA 的質量和純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。使用北京全式金公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 第1 鏈合成試劑盒反轉錄合成cDNA 第1 鏈。使用TaKaRa SMARTer? RACE 5’/3’ Kit 試劑盒合成 5’及3’RACE cDNA，-20 ℃保存。

2.2 簡并引物設計與合成、PCR 擴增UGPase 基因序列及信息生物學分析

根據GenBank 中已注冊的植物UGPase基因部分或全長序列（基因編號 JX294909.1、XM_020741275.1、FJ536261.1、XM_021452444.1等），采用MEGA7.0 軟件的多序比對功能檢索不同植物UGPase基因序列中重合度較高的部分，設計出簡并引物：UGPase-F：5’-GAGTGGAGYAAGATYCAGAC-3’，UGPase-R：5’-AACCAKACATCACCAGARACCTTCA-3’。目的產物約1170 bp。引物由北京擎科新業生物技術有限公司杭州合成部合成。

以“2.1”項獲得的cDNA 為模板，UGPase-F、UGPase-R 為上下游引物進行PCR 擴增。PCR 擴增體系為：50 μL 反應體系，含2×Flash Hot Start MasterMix 25 μL、上下游引物各2 μL、cDNA 模板2 μL、ddH2O 19 μL。PCR 反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，51.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃延伸 2 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，經北京全式金公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒純化后與PMD 18-T載體進行連接，將重組載體轉入到DH5α 大腸桿菌感受態細胞中。過夜培養后篩選8 個陽性菌落進行測序分析，將測序結果進行BLAST 比對分析，驗證測序結果的正確性。

根據上述測序得到的UGPase基因保守區序列，利用Primer5 設計特異性引物，3’RACE 引物為3-UGPase 5’-GGTGGCACGCTAATCTCATATGAAGGAAG-3’，5’ 的 RACE 引物為 5-UGPase 5’-ATGGGAAGACATCACCGTGCCCTGGAG-3’。2次RACE-PCR 反應體系均為50 μL，包括SeqAmp DNA Polymerase 1 μL、2×SeqAmp Buffer 25 μL、PCR-Grade H2O 15.5 μL、5’or3’RACE cDNA 2.5 μL、3-UGPaseor5-UGPase 1 μL、10×UPM 5 μL。PCR程序為5’RACE：94 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5個循環；94 ℃、30 s，70 ℃、30 s，72 ℃、3 min，5 個循環；94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、3 min，30 個循環；4 ℃保溫。3’RACE：94 ℃、30 s，68 ℃、30 s，72 ℃、3 min，30 個循環；4 ℃保溫。后續實驗步驟同保守區克隆過程。

得到UGPase基因完整序列后，使用ExPASy中的Translate 工具將基因序列翻譯成氨基酸序列，使用ProtParam 軟件分析蛋白質的基本性質。使用Net Phos 3.1 Server 軟件分析蛋白質的磷酸化位點，使用NetOGlyc 4.0 軟件分析蛋白質的糖基化位點。使用TMHMM-2.0 軟件分析蛋白質的跨膜情況，使用SignalP-5.0 軟件分析蛋白質的信號肽，使用SoftBerry 網站分析蛋白質的亞細胞定位。使用SOPMA 軟件分析蛋白質的二級結構，使用SWISS-MODEL 軟件分析蛋白質的三級結構。在NCBI 中的Conserved Domain Database（CDD）在線軟件中分析蛋白質結構功能域，最后在MEGA7.0軟件中使用鄰位相連法（neighbor-joining）構建UGPase 蛋白的系統進化樹。

2.3 UGPase 基因表達量、相關酶活性與不同金線蓮多糖含量測定及分析

按照“2.1”項的方法提取7 個不同品種金線蓮組培期及種植期莖段qRT-PCR cDNA，按照“2.2”項得到的測序結果，設計 qRT-PCR 引物，UGPase-YGF：5’-GATTATCCCAAACCCAAAGG-3’，UGPase-YGR：5’-AGAGGGGTTAGCAGGATTTG-3’；預計擴增長度232 bp。選擇金線蓮Actin-2[16]基因作為內參基因，Actin-2-F：5’-CGGGCATTCACGAGACCAC-3’，Actin-2-R：5’-AATAGACCCTCCAATCCAGACACT-3’。分別以不同品種的莖段cDNA 為材料，UGPase-YGF、UGPase-YGR 為上下游引物進行qRT-PCR 反應，反應體系共20 μL：Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物以及DNA 模板各0.4 μL，ddH2O 8.8 μL。擴增程序：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環；qRT-PCR 結果按照公式2-ΔΔCt[17]計算。

以7 個不同品種金線蓮莖段液氮研磨后離心取上清液為材料，采用上海科興公司的酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒數據檢測不同品種金線蓮組培期及種植期莖段中的UGPase 酶酶活性。另外以個不同品種金線蓮莖段固體粉末為材料，采用苯酚-硫酸法[18]測定不同品種金線蓮莖段中多糖含量。分析采用SPSS24.0 軟件進行單因素方差分析并采用Pearson 雙變量相關性法[19]結合多糖含量、基因表達量及酶活進行修改下分析。

3 結果與分析

3.1 總RNA 的提取及金線蓮UGPase 基因的克隆

金線蓮總RNA 的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2-D，可清晰地看到2 條RNA 條帶（28 S 和18 S）其中28 S 條帶亮度大約是18 S 條帶的2 倍，A260/A280值在2.08，可進行下一步的cDNA 第一鏈合成實驗[20]及RACE cDNA 合成實驗。測序得到中間序列1160 bp（圖2-A）、5’端序列657 bp（圖2-B）和3’端序列924 bp（圖2-C）。拼接各片段，得到UGPase基因cDNA 序列全長1786 bp。開放閱讀框為1425 bp，編碼475 個氨基酸，cDNA 全長中還包含5’非編碼區53 bp，3’非編碼區308 bp，以及起始密碼子ATG、終止密碼子TGA 和多聚A 尾。將全長序列上傳至GENBANK，獲得NCBI 登錄號MT978185。

圖2 UGPase基因全長序列的克隆及總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 The cloning of full nucleotide sequences of UGPase gene

3.2 金線蓮UGPase 基因信息生物學分析

通過Protparam 軟件預測得到：UGPase 蛋白相對分子質量為64 996.47，理論pI 為6.40，氨基酸中亮氨酸（Leu）占比最高，達到10.8%，分子式為C2969H4711N757O846S14。在體外哺乳動物網織紅細胞中預測半衰期為30 h，不穩定指數為34.49，屬于穩定蛋白，脂肪系數為108.41，親水性平均值為0.096，屬于疏水蛋白。通過Net Phos 3.1 Server及NetOGlyc4.0 軟件預測得到：UGPase 蛋白有磷酸化位點47個，其中絲氨酸24 個，蘇氨酸17 個，酪氨酸6 個。有糖基化位點4 個，分別在第67、71、73 及82 個氨基酸。通過SignalP-5.0、TMHMM-2.0 及SoftBerry網站預測得到：UGPase 蛋白存在信號肽，位置可能位于第22～23 個氨基酸，表明該蛋白為分泌型蛋白，同時該蛋白存在跨膜位點，跨膜區可能位于第494～516 個氨基酸，表明該蛋白為跨膜蛋白，亞細胞定位系數表明，UGPase 蛋白定位于細胞質的可能性最高。通過SOPMA及SWISS-MODEL軟件預測得到：UGPase 蛋白具有203 個α-螺旋（alpha helix），占比34.18%；137 個延伸鏈（extended strand），占比23.06%；49 個β-轉角（beta turn），占比8.25%；205 個無規卷曲（random coil），占比34.51%，三級結構預測結果見圖3。通過CDD 軟件分析得到：UGPase 蛋白屬于糖基轉移酶家族A（Glyco_tranf_ GTA_type）成員之一，具有PLN02474（位于第22～486 位氨基酸）、UDPGP（位于第48～458 位氨基酸）、UGPase_euk（位于第97～396 位氨基酸）及QRI1（位于49～486 位氨基酸）4 個結構域。

圖3 金線蓮UGPase 蛋白三級結構Fig.3 Tertiary structure of UGPase protein from Anoectochilus roxburghii

通過 BLAST 氨基酸序列比對發現金線蓮UGPase 氨基酸序列與鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo（AGA17038.1）、蝴蝶蘭Phalaenopsis equestris(Schauer)Rchb.f.（XP_ 020596934.1）、深圳擬蘭Apostasia shenzhenicaZ.J.Liu&L.J.Chen（PKA66203.1）、蘆筍Asparagus officinalisL.（XP_020273555.1）、油棕Elaeis guineensisJacq.（XP_010935335.1）、糜子Panicum miliaceumL.（RLN32892.1）、海棗Phoenix dactyliferaL.（XP_008804801.1）、菠蘿Ananas comosus(Linn.)Merr.（OAY68359.1）、狗尾草Setaria viridis(L.)Beauv.（XP_034583618.1）、高粱Sorghum bicolor(L.)Moench（XP_ 002453185.1）和甘蔗Saccharum officinarumL.（ACL80329.1）的相似性分別達到88.60%、87.96%、86.51%、85.31%、85.07%、84.55%、84.01%、83.80%、82.86%、82.43%和85.34%。其中金線蓮UGPase 氨基酸序列與同屬蘭科的鐵皮石斛、同源性最高（圖4）。選取了一部分典型的單子葉植物使用MEGA7.0 軟件構建系統進化樹（圖5），進行分子系統學分析，系統進化樹結果顯示，金線蓮與鐵皮石斛、蝴蝶蘭、深圳擬蘭、油棕、海棗聚為一大支，其中進行與鐵皮石斛、蝴蝶蘭具有最近的親緣關系，這可能由于3 種植物都屬于蘭科，所以親緣較近。

圖4 金線蓮UGPase 氨基酸序列與其他植物比對結果Fig.4 Results of comparison of UGPase amino acid sequence with other plants

圖5 12 種植物UGPase 蛋白進化樹Fig.5 Evolutionary tree of UGPase protein in 12 plant species

3.3 不同品種金線蓮多糖含量測定

不同品種金線蓮莖段多糖含量測定結果見圖6所示。結果顯示，在這7 個品種中，金線蓮莖段多糖變化趨勢均為明顯上升，且每個品種在2 個時期中莖段多糖含量均不相同，在組培期莖段中多糖含量最高的是無紋品種，最低的是匠康2 號品種，所有品種之間均存在顯著差異，而在種植期莖段中多糖含量最高的是匠康1 號，最低的是匠康2 號，所有品種之間均存在顯著差異。從組培期至種植期多糖增加最多的是小葉品種，最少的是匠康2 號品種，多糖含量最少增加了1 倍以上，最多達到了9 倍。

圖6 不同品種金線蓮莖段多糖含量測定Fig.6 Determination of polysaccharides in different varieties of Anoectochilus roxburghii

3.4 不同品種金線蓮UGPase 基因的表達分析

不同品種金線蓮UGPase基因熒光定量PCR 實驗結果結果如圖7所示，結果顯示，UGPase基因在7個不同品種金線蓮2個時期的莖段中均有表達，但在不同時期具有有不同的表達水平。在組培期，莖段中表達最高為無紋品種，最低為圓葉品種，其中無紋品種與匠康1 號、尖葉品種表達量有顯著差異，而這2 個品種與健君、小葉和匠康2 號3 個品種莖段表達量有顯著差異，最后表達量最小的圓葉品種和前面3 個品種有顯著差異。種植期莖段表達量最高同樣是無紋品種，最低為匠康2 號品種，無紋品種與匠康1 號品種與其他5 個品種莖段表達量有顯著性差異。另外在組培期到種植期之間，7 個品種金線蓮莖段部位的表達量均呈現上升趨勢，且增加趨勢較為明顯。

圖7 不同品種金線蓮UGPase 基因莖段表達量Fig.7 Relative expression levels of UGPase of stem in different varieties of Anoectochilus roxburghii

3.5 不同品種金線蓮UGPase 酶的酶活性測定

不同品種金線蓮莖段UGPase 酶活性測定結果如圖8所示。結果顯示，UGPase 酶在7 個不同品種金線蓮2 個時期的莖段中均有活性，但在不同時期酶活變化不大。在組培期，莖段中酶活最高為圓葉品種，最低為匠康2 號品種，7 個品種莖段部位酶活均無顯著差異。種植期莖段酶活最高匠康1 號品種，最低為匠康2 號品種，匠康2 號品種較其他6 個品種莖段酶活略低。另外在組培期到種植期之間，7 個品種的金線蓮莖段部位酶活均呈現上升趨勢，但沒有出現大幅度增加的情況。

圖8 不同品種金線蓮UGPase 酶莖段酶活Fig.8 Enzymatic activity of UGPase of stem and leaf in different varieties of Anoectochilus roxburghii

3.6 不同品種金線蓮多糖與表達、酶活性相關性分析

通過SPSS 軟件對實驗結果進行相關性分析，結果如表1所示。不同品種不同時期金線蓮莖段部位多糖含量變化均與UGPase基因表達量以及酶活呈極顯著正相關性，而表達量與多糖含量的相關系數要高于酶活，另外，UGPase基因表達量與單獨組培時期以及單獨種植時期不同品種金線蓮莖段部位多糖含量均呈極顯著正相關，相關系數較與不同品種不同時期金線蓮莖段部位多糖含量略小。但酶活只與單獨種植時期不同品種金線蓮莖段部位多糖含量呈極顯著正相關，與單獨組培時期多糖含量并未有顯著相關性，而且與種植期多糖含量相關系數同樣小于與不同品種不同時期金線蓮莖段部位多糖含量的相關系數。

表1 金線蓮多糖含量與UGPase 基因表達量及酶活相關性分析Table 1 Analysis of correlation between polysaccharide content and expression of UGPase gene or enzyme activity in Anoectochilus roxburghii

4 討論

植物多糖具有調節免疫功能、抑制腫瘤、延緩衰老、抗疲勞、降血糖、抗輻射、抗菌抗病毒及保肝等作用。為了利用植物基因工程、細胞工程工業化大量生產該重要活性成分，多糖合成途徑及調控的關鍵酶基因成為研究熱點，植物多糖合成途徑是植物糖代謝相關途徑的一部分，植物的糖代謝相關途徑是整個植物生物代謝的中心，它勾通了蛋白質代謝、脂類代謝、核酸代謝及次生物質代謝。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）是植物糖代謝途徑中的一個關鍵酶，其首先由Munch-Petersen、Kalckar 和Cutolo 于1953年在酵母細胞中發現[21]，近年來，國內外學者已在黨參[22]、白花泡桐[23]、龍須菜[24]、黃芪[25]、鐵皮石斛[26-27]、落葉松[28]、海帶[29]和紫穗槐[30]等植物中克隆分離出UGPase基因。它催化反應UTP＋葡萄糖-1-P?UDP-葡萄糖＋PPi，在不同的植物組織中，其催化方向有所不同。在源組織中，二氧化碳經卡爾文循環固定生成磷酸丙糖后，將其轉化為果糖-1-6-二磷酸，然后在磷酸酶、己糖磷酸變位酶以及葡萄糖磷酸變位酶的催化下生成葡萄糖-1-磷酸隨后經UGPase 催化生成UDP-葡萄糖，為蔗糖的生物合成提供底物其產物[31]，在庫組織中，催化蔗糖的降解，即催化UDP-葡萄糖生成葡萄糖-1-磷酸[32]。UGPase 還與胞液中的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）相偶聯，形成腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG），參與造粉體淀粉的合成[10,33]。生物體合成多糖的前提是單糖以活化的形式存在，使其可以被充分利用，UDP-Glc 作為活化糖，它在被UGPase 經葡萄糖催化生成后充分參與到植物中多種多糖類物質的合成中，是植物多糖合成的關鍵酶。

本研究利用已報到的其他植物UGPase基因序列，首次從蘭科植物金線蓮中克隆出UGPase基因全長序列，該基因全長1786 bp。開放閱讀框為1425 bp，編碼475 個氨基酸，在NCBI 上進行在線BLAST 序列比對，UGPase 氨基酸序列同源性比對及系統進化樹分析顯示，金線蓮UGPase 氨基酸片段與其他植物有較高的同源性（88.60%～82.43%），其中與鐵皮石斛等蘭科植物同源性最高，表明UGPase基因編碼區高度保守，與前人報道的結果非常相似[34]。另外李帥玲[35]研究得出金線蓮是多糖積累型植物，其主要積累部位為根莖，其他部位多糖幾乎可忽略不計，因此本研究選擇7 個不同品種金線蓮的莖段來作為實驗材料。在本研究中發現，不同品種金線蓮之間多糖含量具有顯著性差異，這與魏翠華等[36]、施滿容等[37]研究結果類似。UGPase基因表達量在不同品種金線蓮莖段中與多糖含量呈極顯著正相關，這與在鐵皮石斛[38]的類似研究中結果一致。此外，UGPase 酶活性也同樣與多糖含量存在極顯著正相關，不過相關系數較表達量小。由此可以初步判斷UGPase基因確實參與金線蓮多糖合成代謝途徑，在主要多糖積累部位參與調控多糖的合成積累。

本研究以尖葉金線蓮莖段為材料，克隆出金線蓮UGPase基因全長。通過氨基酸序列同源性分析及系統進化樹等的方法，可推斷克隆得到的序列片段就是金線蓮UGPase基因的cDNA 片段。另外通過測定7 個不同品種金線蓮莖段UGPase基因表達量及相關酶活，并與多糖含量進行相關性分析，初步證明UGPase基因是參與金線蓮多糖合成代謝的關鍵基因之一。這為金線蓮多糖的合成代謝途徑研究提供了必要的前期準備，并為今后通過分子生物學手段增加其多糖含量奠定基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突