基于熵權法和灰色關聯分析法評價安徽省不同產地黃精藥材質量

馮治國，趙 祺,#，朱 強，宋大偉，范欣榮，葉賽金，鮑康德,*，姜程曦,,4*

1.溫州醫科大學藥學院，浙江 溫州 325035

2.池州市九華山黃精研究所，安徽 池州 247100

3.安徽濟人藥業有限公司，安徽 亳州 236800

4.安徽省九華山佛教醫藥研究所，安徽 池州 247100

黃精為“十大皖藥”之一，因集藥用、食用、觀賞于一身，市場需求量近年來迅速增加，價格不斷提高，應用領域不斷擴大[1]。安徽省藥用黃精主要來源于多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua，適宜生長于表層水分充足且富含腐殖質的砂質土壤及蔭蔽之地[2]。但由于野生黃精類藥材組成成分因土壤、氣候和光照等生境的不同而異[3]，不同產地黃精的質量和臨床效果有很大差別。目前關于黃精藥材質量評價的方法，多集中在生藥學鑒定方面[4]，或基于1 種或2 種指標性成分[5-6]和基于指紋圖譜研究的單一評價模式[7-8]等，綜合評價報道較少。

灰色關聯度分析法（grey relational analysis）是灰色系統分析方法的一種，是根據因素之間發展趨勢的相似或相異程度，作為衡量因素間關聯程度的一種方法[9]。由于灰色關聯度分析蘊含的“灰色思維”與中醫藥理論特點相吻合，已應用于石韋PyrrosiaeFolium[10]、黃柏Phellodendri ChinensisCortex[11]、龍膽GentianaeRadixetRhizoma[12]、牡丹皮MoutanCortex[13]等中藥材的質量評價。熵權法（entropy weight method）是一種客觀賦權法，用來判斷某個指標的離散程度，熵作為不確定性的一種度量。信息量越大，不確定性就越小，熵也就越小[14]。本研究采用熵權法和灰色關聯度法相結合的質量研究模型[15]，以20 個產地野生多花黃精為研究對象，在《中國藥典》2020年版規定的指標基礎上，增加總皂苷、薯蕷皂苷元含量測定，構建安徽省不同產地黃精藥材質量評價的灰色關聯度模型，進行安徽省黃精藥材質量的綜合評價研究，為安徽省多花黃精優質種源的篩選提供了參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SX2-2.5-10Z 箱式電阻爐（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；電子分析天平（d＝0.1mg，賽多利斯科學儀器有限公司）；真空干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；RE-52AA 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；JP-100S 型超聲波清洗機（深圳市潔盟清洗設備有限公司）；SP-754P 型紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；LC-20A 型液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試劑

高氯酸、正丁醇、香草醛、蒽酮、濃硫酸、冰醋酸、無水葡萄糖均為分析純；人參皂苷Rb1（上海安譜實驗科技股份有限公司，批號42520050，質量分數≥98%），薯蕷皂苷元（上海源葉生物科技有限公司，批號B20177，質量分數≥98%）。

1.3 樣品

2018年9月26日～10月7日，先后于青陽縣西華鄉、石臺縣、祁門縣等地方采挖野生多花黃精整株植物，經溫州醫科大學藥學院中藥學教研室鮑康德副教授鑒定所有樣品均來源于百合科黃精屬多花黃精P.cyrtonemaHua，來源見表1。然后將采集的20 批次野生多花黃精去泥土，洗凈，去須根，初加工蒸制15 min 至透心，切厚片，干燥，成為飲片。

表1 安徽省不同產地野生多花黃精樣品來源Table 1 Sources of wild P.cyrtonema from different populations in Anhui Province

2 方法與結果

2.1 基本指標測定

參照《中國藥典》2020年版黃精項下測定20批次黃精藥材的水分、總灰分、酸不容灰分、浸出物和無水葡萄糖含量[16]。每批樣品重復測3 次，結果見表2。

表2 不同產地黃精樣品測定結果Table 2 Determination results of Polygonati Rhizoma from different populations

總灰分含量＝(灰化后總質量－空坩堝質量)/樣品質量

酸不溶灰分含量＝(酸化后總質量－空坩堝質量)/樣品質量

無水葡萄糖含量＝C×Vs×N/M

C為根據標準曲線測的樣品濃度；Vs 試管中溶液體積；N提取液為稀釋倍數；M為樣品質量。

2.2 總皂苷含量的測定

2.2.1 空白溶液制備 加0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液（新鮮配制），冰浴時加0.8 mL 高氯酸，混勻，60 ℃水浴加熱15 min，再冰浴2 min，加5 mL冰醋酸，混勻，靜置5 min，即得[17-19]。

2.2.2 對照品溶液的制備 取人參皂苷Rbl對照品11.3 mg，精密稱定，加甲醇溶解，定容至10 mL，搖勻即得。

2.2.3 供試品溶液制備 將黃精飲片于60 ℃干燥6 h 后，用粉碎機粉碎過四號篩。取黃精樣品粉末1.00 g，精密稱定，加14 倍量水飽和正丁醇，40 ℃超聲提取50 min，濾過，濾渣再提取1 次，合并2次濾液，置25 mL 量瓶中，加水飽和正丁醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.4 標準曲線的繪制 取人參皂苷Rbl對照品溶液40、80、120、160、200 μL，置10 mL 具塞試管中，揮盡溶劑，之后步驟同空白溶液制備方法，以相應試劑為空白，照紫外一可見分光光度法（通則0401），在550 nm 處測定吸光度（A）。以A值為縱坐標（Y），人參皂苷Rbl質量為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程Y＝0.004X－0.0748，R2＝0.999，表明人參皂苷Rbl質量在45.2～226.0 μg 線性良好。

2.2.5 總皂苷的測定 精密量取上述溶液100 μL，揮盡溶劑，之后步驟同空白溶液制備，以相應試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法（通則0401），在550 nm 處測定A值。計算結果見表2。

皂苷含量＝M1×250/M2

M1為根據標準曲線測的樣品質量，M2為樣品質量

2.3 薯蕷皂苷元含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷元5 mg 倒入5 mL 量瓶中，加入甲醇至刻度，充分搖勻，制成含1 mg/mL 薯蕷皂苷元對照品溶液。采用0.22 μm 的濾膜濾過，低溫保存，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取黃精樣品粉末2 g 置燒瓶內，加入100 mL 的80%乙醇，充分搖勻，稱定質量，加熱回流3 h，待冷卻后再稱量，減少的質量用乙醇補足，充分搖勻，抽濾，取濾液備用。準確量取40 mL 的濾液，旋干乙醇后加3 mol/L 鹽酸溶液100 mL 溶解，加熱回流3 h，待冷卻后，再移到分液漏斗內，加入20 mL 正丁醇萃取，重復2 次，保留正丁醇層，再次旋干，殘渣加甲醇10 mL 定容至刻度，再加10 mg/mL 殼聚糖冰醋酸溶液0.001 mL，過夜，采用0.22 μm 的濾膜濾過，低溫保存[20]。

2.3.3 色譜條件 Hypersil ODS2（200 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈（A）-水（B）為流動相，梯度洗脫：0～2 min，5%～10% A；2～10 min，10%～35% A；10～15 min，35%～60% A；15～20 min，60%～80% A；20～25 min，80%～100% A。體積流量0.2 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長203 nm，進樣量10 μL。

2.3.4 方法學考察 根據文獻方法[20]測定穩定性、重復性、精密度及加樣回收率。樣品溶液在4 ℃條件下放置24 h，穩定性試驗RSD 為0.70%，精密度試驗RSD 為0.42%，重復性試驗RSD 為1.4%，平均加樣回收率為100.3%，RSD 為0.65%，均符合要求。

2.3.5 樣品的測定 取供試品溶液進樣，按照“2.3.3”項下色譜條件，“2.3.2”項下制備方法，色譜圖見圖1，結果見表2。

圖1 薯蕷皂苷元(A)和黃精藥材(B)HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of iosgenin reference substance(A)and Polygonati Rhizoma (B)

通過以上結果，表明黃精藥材符合《中國藥典》2020年版規定，含水量在10.427%～11.740%，ST2水分最少，GC3 水分最多；總灰分在1.486%～2.513%，酸不溶灰分在0.181%～0.312%，GC3 總灰分最少，ST2 總灰分和酸不溶灰分最多；浸出物在81.001%～88.955%，YX2 浸出物含量最少，QM3含量最多；無水葡萄糖含量在11.154%～14.659%，NL2 含量最少，QM3 含量最多；總皂苷含量在0.714%～0.898%，YX2 含量最少，QY2 含量最多；薯蕷皂苷元含量在0.008%～0.017%，YX1 含量最少，QY2 含量最多。

2.4 熵權法

2.4.1 數據標準化處理：假設給定了k個指標，n個樣本（n＝20，k＝7），對原始數據進行標準化處理，標準化處理公式：

Xij為原始數據，Xi為樣品第i個指標的均值。

2.4.2 求各指標的信息熵 根據信息論中信息熵的定義，一組數據的信息熵（Ej）：

pij=Yij/∑Yij，若pij=0，則定義lnpij=0。

確定各指標權重各個指標的信息熵后，計算各指標的權重（Wi），計算結果見表3。

表3 熵權法計算所得信息熵及權重Table 3 Information entropy and weight calculated by entropy weight method

Ei為樣品第i個指標的信息熵。

2.5 灰色關聯度法

2.5.1 原始數據標準化處理 為了更好的實現數據的計算和管理，需對原始數據進行規格化處理[21-22]，規格化處理公式：

Xik為原始數據，Xk為樣品第k個指標的均值。

2.5.2 關聯系數的計算 設其中最優參考序列記為{Ysk}，最差參考序列記為{Ytk}，相對于最優參考序列和最差參考序列的關聯系數分別按公式（5）、（6）計算：

ρ為分辨系數，本實驗ρ取值為熵權法“2.4.2”項下計算所得各指標關聯系數，計算結果見表4。

表4 各評價單元相對于最優參考序列的關聯系數Table 4 Correlation coefficients of each evaluation unit with respect to optimal reference sequences

2.5.3 關聯度的計算：最優參考序列關聯度ri(s)和最差參考序列關聯度ri(t)分別按公式（7）和公式（8）計算：

2.5.4 相對關聯度的計算 相對關聯度ri與最優參考序列關聯度ri(s)和最差參考序列關聯度ri(t)密切相關，計算方法如下：

計算結果見表5，根據相對關聯度的大小對評價單元序列進行排序，最終得到優劣評價結果。

表5 不同產地黃精樣品相對關聯度及質量排序Table 5 Relative correlation degrees and quality ranking orders of Polygonati Rhizoma from different populations

從質量研究角度分析，浸出物、有效成分含量越高質量越好[23-24]。本研究通過以浸出物、總皂苷、薯蕷皂苷元含量等7 種指標，通過灰色關聯模型和熵權模型，對安徽省野生多花黃精進行質量評價，發現黃精藥材相對關聯度介于0.464 8～0.657 7，說明安徽省內各產地黃精的質量存在一定差異；依據不同產地黃精的相對關聯度大小，相對關聯度＞0.55 的樣品有11 批，相同縣內不同海拔的黃精藥材相對關聯度略有差異，總體上祁門縣的黃精質量評價度最高，這與吳其國等[25]、錢楓等[26]的研究結果基本一致。此外，祁門縣、貴池區、青陽縣的樣品排名靠前，品質較優，可在以上產地區域建立高品質栽培基地，規范加工方法，能總體提高黃精藥材質量。相對關聯度＜0.55 的樣本集中在石臺、岳西、金寨、南陵等地，樣品的排名相對靠后，品質較差，其中岳西縣的黃精質量評價度最低，可能與藥材的土壤特性、生長環境和地理位置有關。

3 討論

黃精屬于多基原藥材，一般來說，多花黃精以安徽、湖南、貴州所產質量較優[27]。近年來隨著人們日益增長的健康需求，黃精產業發展逐步邁入快車道，安徽各地區廣泛種植黃精。但由于氣候、水肥等生境的不同，導致黃精藥材各化學成分含量存在差異[28]。本研究通過綜合評價黃精藥材質量，發現祁門縣、貴池區、青陽縣品質較優，說明可在以上產地區域建立黃精規范化種植基地，基于多指標成分構建的熵權和灰色關聯度模型評價安徽省不同產地黃精藥材質量，方法簡單客觀，為黃精優質種源的篩選提供了參考依據。

質量是中藥產業的生命線，中藥質量諸多問題是阻礙中藥現代化、國際化的瓶頸之一[29]。中藥成分復雜，各成分間通過多維度、多層次非線性協同作用發揮藥效[30]，因此評價中藥質量僅以單一化學成分為指標具有一定局限性，應該進行多指標綜合評價。且由于灰色關聯度計算中各計算指標ρ 沒有一個量化的方法，多數沿用文獻中的方法取ρ＝0.5（指標數量≥4）[31-32]，分析結果不夠真實客觀，而將各評價指標根據熵權法賦值進行區分后，再用灰色關聯度質量評價模型進行分析，可以區分不同指標對整體的影響。本實驗圍繞中藥成分有效性、可測性、特有性的屬性，建立中藥多成分體系宏觀質量表征的灰色關聯模型和熵權模型，選擇了基礎指標水分、灰分，加上浸出物、無水葡萄糖含量、總皂苷等有效成分，共7 個指標，能較客觀地反映其內在質量。但由于黃精多糖結構復雜，結構鑒定、次生代謝研究還不夠深入，從現有的成分指標難以全面評價，且尚未發現黃精特有成分，因此，未來還需從黃精原植物體內中藥化學代謝途徑、節點代謝或代謝網絡研究，多角度、全方位地研究黃精有效成分，從而實現黃精藥材質量評價體系從點到面的轉變。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突