基于PLC/IP3通路探討巖黃連對新生兒高膽紅素血癥大鼠聽覺系統損傷的影響

雷瑞瑞，周栩平，王新華，李晶晶，周 靜

1.駐馬店市中心醫院 新生兒及NICU 科，河南 駐馬店 463000

2.鄭州大學第二附屬醫院 新生兒科，河南 鄭州 450002

3.駐馬店市中心醫院 臨床藥學室，河南 駐馬店 463000

新 生 兒 高 膽 紅 素 血 癥（neonatal hyperbilirubinemia，NH）又稱新生兒黃疸，是指由于膽紅素代謝異常使血中膽紅素水平升高，導致皮膚、黏膜及鞏膜黃染的病癥[1-2]。NH 是新生兒常見病癥，可導致新生兒急慢性腦病、臟器損害、神經毒性及聽力下降，甚至死亡等，嚴重危害新生兒生命健康[3-4]。聽覺中樞更易受膽紅素毒性損害，據流行病學分析，超過70%的NH 患者可出現腦干聽覺核團、前庭核、下丘核等特定中樞核團的功能損害癥狀[5-6]。然而雖然學術界認同NH 容易導致聽覺損傷，但其聽覺損害及中樞神經毒性機制還不甚明確，這使得臨床仍缺乏特異性、有效性的防治藥物。近來研究發現，磷脂酶C（phospholipase C，PLC）/三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）通路可介導腦組織神經元凋亡發揮腦神經保護作用[7]，且能觸發內質網鈣庫釋放，促進新生大鼠耳蝸血管紋緣細胞釋放三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），調節聲轉導、聽敏度等生理活動[8]。故研究PLC/IP3通路在NH 病理過程中的調控機制，對闡明聽覺損害及中樞神經毒性機制具有潛在臨床價值。傳統中藥巖黃連Corydalis saxicolaBunting 富含生物堿，臨床上常用于治療急慢性肝炎、病毒性肝炎、高膽紅素血癥、肝癌及其他腫瘤的輔助治療[9]。近年來研究發現，巖黃連可減輕NH 的程度和持續時間及NH 用藥過程中的不良反應，對NH 有較好的治療效果[10]。但巖黃連治療NH 的具體機制及對聽覺損害的影響還未見報道，本研究建立NH 大鼠模型，給予巖黃連治療，探究巖黃連對NH 大鼠PLC/IP3通路及聽覺損傷的影響，以期闡明巖黃連治療NH的作用機制，為其臨床合理用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 7 d 齡清潔級SD 大鼠50 只，體質量15～20 g，雌雄不限，動物均無耳毒性藥物使用及強噪聲暴露史，由廣東省醫學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK（粵）2018-0002。所有大鼠于本院動物房中飼養，自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%，噪音低于80 dB，保持動物房環境及鼠籠清潔、透氣。本實驗經駐馬店市中心醫院倫理委員會批準（批準號ZMD-20200109 0034），實驗動物符合3R 原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 巖黃連對照藥材（貨號A-121416-1g）購自上海信帆生物科技有限公司，經駐馬店市中心醫院周靜藥師鑒定為巖黃連C.saxicolaBunting；膽紅素（貨號QN0823-PFQ，橙色至暗紅棕色結晶體）購自北京百奧萊博科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號G1120）購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠總膽紅素酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（貨號DIBR-180）購自北京冬歌博業生物科技有限公司；鈣素（calcium，CaM）、磷酸化PLC（p-PLC）、IP3 抗體（貨號分別為ab181052、ab68148、ab252536），均購自美國Abcam 公司；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶（貨號分別為P0768、P0231），均購自美國Pierce 公司。

RM2125RTS 型手動輪轉式切片機（德國Leica公司）；SMZ745 光學顯微鏡（日本尼康公司）；1659001 型蛋白電泳儀、Trans-Blot SD 半干轉膜儀（美國Bio-Rad 公司）；GIS-500 凝膠成像儀（杭州米歐儀器有限公司）；CHARTR EP/ASSR 腦干誘發電位儀、TDH-39 氣導耳機（丹麥Interacoustics 公司）。

1.2 方法

1.2.1 巖黃連藥液的制備 參照文獻方法[11]，巖黃連藥材用蒸餾水煎煮，取水提液濃縮干燥（每克干燥物中含生藥量8 g），取干燥物用生理鹽水配制成0.5、1.0、2.0 mg/mL（相當于生藥量4.0、8.0、16.0 mg/mL）的溶液（其中含巖黃連總生物堿0.28～1.12 mg/mL）。

1.2.2 NH 大鼠模型建立及分組與給藥 出生后7 d的SD 大鼠50 只，采用隨機數字表法分為對照組、模型組及巖黃連低、中、高劑量（40、80、160 mg/kg）組，每組10 只；除對照組外，其余各組新生大鼠均參照文獻方法[12]按200 μg/g的劑量ip膽紅素溶液（20 mg 晶體膽紅素溶于1 mL 0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液中，加入蒸餾水9 mL，用0.05 mol/L 的鹽酸調節pH 8.5，終質量濃度為2 mg/mL，按1 mL/kg 劑量給藥）建立NH 模型，藥物注射后于恒溫、恒濕和避光環境中自然哺育24 h，并觀察大鼠行為活動，若大鼠出現煩躁、翻滾現象，表明造模成功。對照組大鼠ip 等量生理鹽水后置于同樣條件下哺育24 h。各組均于注射膽紅素后30 min 開始給藥，按10 mL/kg ig給予相應劑量的巖黃連藥液，對照組及模型組按10 mL/kg ig 給予生理鹽水，各組均給藥1 d，3 次/d。

1.2.3 大鼠一般行為觀察 各組大鼠末次給藥2 h后，觀察大鼠有無煩躁、翻滾及俯伏等異常神經行為活動，耳廓反射及對外界刺激反應靈敏程度。

1.2.4 大鼠聽性腦干反應（auditory brainstem response，ABR）檢測 各組大鼠置于隔聲屏蔽室[本底噪聲不大于30 dB 聲壓級（sound pressure level，SPL）]中，麻醉后，用TDH-39 型氣導耳機給聲并緊貼大鼠外耳道口，設置腦干誘發電位儀聽覺誘發參數為帶通濾波100～3000 Hz，描時10 ms，疊加次1024 次，刺激聲為交替短聲。設置完參數，接通點擊后開始進行測試，ABR 反應閾的判斷以II波為標準，刺激強度從90 dB SPL 開始，10 dB 一檔遞減至II波不可辨別，再以80 dB 的刺激強度測試大鼠雙耳的各波潛伏期和波間期。數據經測試系統自身的微機自動讀取、存儲。

1.2.5 大鼠血清及腦干組織標本采集及膽紅素含量測定 各組大鼠在測完ABR 后，腹主動脈取血0.5 mL，置于室溫1 h，凝固后，置4 ℃下過夜，析出血清，3000 r/min 離心10 min 后，取上清液加于測試管中，按膽紅素ELISA 試劑盒說明書方法檢測血清膽紅素含量。將大鼠麻醉，開胸，經左心室快速灌注生理鹽水，沖凈血液，隨后緩慢灌注多聚甲醛磷酸緩沖液，然后斷頭處死，開顱取腦干組織，剪取1 g 后備用，剩余部分迅速置于上述灌注液中固定1 周備用。從1 g 腦干組織中剪取0.5 g，加0.5 mL冰醋酸勻漿后，再加0.5 mL 丙酮混勻，于3000 r/min離心10 min 后取上清液0.2 mL，按膽紅素ELISA試劑盒說明書方法檢測血清膽紅素含量，剩余腦干組織迅速置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.6 大鼠耳蝸核標本制作及HE、CaM 免疫組化染色檢測 取“1.2.5”項下4%多聚甲醛溶液中固定1周的腦干組織，經脫水、透明、石蠟包埋后，經面神經根平面向后做連續冠狀切片，片厚7 μm，取從耳蝸核開始出現至消失的切片，共2 套，一套根據HE 試劑盒說明書進行HE 染色，并在顯微鏡下觀察組織變化，另一套用二甲苯脫蠟、3%過氧化氫消化過氧化物酶活性后，滴加1∶500 的CaM 抗體，行CaM 免疫組化染色，在共聚焦顯微鏡下觀察切片中細胞染色情況，采用Image-pro plus 定量檢測染成棕黃色細胞數數目，并計算CaM 陽性細胞表達率。耳蝸核定位參照《常用實驗動物腦立體定位圖譜》[13]和《大白鼠中樞神經系統解剖學基礎》[14]進行。

CaM 陽性細胞表達率＝染成棕黃色細胞數/細胞總數

1.2.7 Western blotting 法檢測腦干組織p-PLC、IP3蛋白相對表達量 取“1.2.5”項中-80 ℃保存的腦干組織，于4 ℃冰箱中解凍后，用組織勻漿器勻漿，離心分離后，取上清液，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，蛋白定量BCA 試劑盒檢測蛋白總濃度后，取50 μg 蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，TBST 溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗3 次后，加入一抗[p-PLC、IP3、β-actin（內參）]抗體，稀釋倍數分別為1∶1000、1∶1000、1∶2000），4 ℃搖床室溫孵育過夜，TBST 振洗后加入HRP 羊抗兔二抗（稀釋倍數1∶2000），37 ℃搖床室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次后，采用增強化學發光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J 軟件分析各組蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析

以SPSS 22.0 軟件對實驗數據進行統計分析，計量資料以x±s表示，多組間比較進行單因素方差分析，進一步兩組間比較進行Snk-q檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般行為

對照組大鼠行為活動正常，無煩躁、翻滾及俯伏等異常神經行為活動，耳廓反射及對外界刺激反應靈敏；與對照組相比，模型組大鼠出現煩躁、翻滾及俯伏等異常神經行為活動，且耳廓反射及對外界刺激反應遲鈍；與模型組相比，巖黃連低、中、高劑量組大鼠煩躁、翻滾及俯伏等異常神經行為活動明顯減少，且耳廓反射及對外界刺激反應遲鈍現象得到不同程度改善。

2.2 各組大鼠ABR 各波潛伏期及閾值

與對照組相比，模型組大鼠ABR 閾值升高（P＜0.05），I、II、III波潛伏期明顯延長（P＜0.05）；與模型組相比，巖黃連低、中、高劑量組大鼠ABR閾值降低（P＜0.05），I、II、III波潛伏期明顯縮短（P＜0.05），且巖黃連各劑量組上述指標呈劑量相關性，見表1。

表1 各組大鼠ABR 各波潛伏期及閾值(±s,n=10)Table 1 Incubation period and threshold of ABR wave in each group(±s,n=10)

表1 各組大鼠ABR 各波潛伏期及閾值(±s,n=10)Table 1 Incubation period and threshold of ABR wave in each group(±s,n=10)

與對照組比較：aP＜0.05；與模型組比較：bP＜0.05；與巖黃連低劑量組比較：cP＜0.05；與巖黃連中劑量組比較：dP＜0.05，下表同aP＜0.05 vs control group;bP＜0.05 vs model group;cP＜0.05 vs C.saxicola low-dose group;dP＜0.05 vs C.saxicola medium-dose group,same as below tables

潛伏期/ms組別 劑量/(mg·kg-1)I波 Ⅱ波 Ⅲ波 閾值/dB SPL對照 － 1.09±0.02 1.51±0.04 2.52±0.03 16.66±1.29模型 － 1.39±0.04a 2.31±0.05a 3.41±0.04a 54.23±1.51a巖黃連 40 1.31±0.03ab 2.01±0.04ab 3.11±0.03ab 40.32±1.42ab 80 1.22±0.02abc 1.77±0.03abc 2.81±0.04abc 29.67±1.36abc 160 1.11±0.02bcd 1.62±0.03bcd 2.54±0.03bcd 19.08±1.22bcd

2.3 各組大鼠血清及腦干組織膽紅素含量

與對照組相比，模型組大鼠血清及腦干組織膽紅素含量升高（P＜0.05）；與模型組相比，巖黃連低、中、高劑量組大鼠血清及腦干組織膽紅素含量降低（P＜0.05），且巖黃連各劑量組血清及腦干組織膽紅素含量呈劑量相關性，見表2。

表2 各組大鼠血清及腦干組織膽紅素含量(±s,n=10)Table 2 Content of bilirubin in serum and brain stem tissue of rats in each group(±s,n=10)

表2 各組大鼠血清及腦干組織膽紅素含量(±s,n=10)Table 2 Content of bilirubin in serum and brain stem tissue of rats in each group(±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1)血清膽紅素/(μmmol·L-1)腦干組織膽紅素/(nmmol·L-1)對照 － 15.09±1.92 0.00±0.00模型 － 511.39±10.24a 4.01±0.15a巖黃連 40 301.31±9.93ab 3.21±0.14ab 80 102.22±8.02abc 1.07±0.03abc 160 17.11±2.02bcd 0.09±0.03bcd

2.4 各組大鼠耳蝸核組織HE 染色

對照組大鼠耳蝸核組織正常，染色均勻。與對照組相比，模型組大鼠耳蝸核組織可見膽紅素沉積，各亞核神經細胞腫脹、數目減少，胞漿皺縮且有空泡形成，脂褐素沉積增多，尼氏體減少等病理現象嚴重。巖黃連低、中、高劑量組上述病理損傷得到不同程度改善。見圖1。

圖1 各組大鼠耳蝸核組織HE 染色圖(×400)Fig.1 HE staining of cochlea nucleus tissue of rats in each group(× 400)

2.5 各組大鼠耳蝸核組織CaM 免疫組化染色

對照組大鼠耳蝸核組織細胞染色正常，無棕黃色顆粒沉積。與對照組相比，模型組大鼠耳蝸核組織細胞核染色較淺，棕黃色或棕色顆粒增多，CaM陽性表達率增高（P＜0.05）；與模型組相比，巖黃連各劑量組棕黃色或棕色顆粒明顯減少，且CaM 陽性表達率呈劑量相關性降低（P＜0.05）。見圖2 和表3。

表3 各組大鼠耳蝸核組織CaM 陽性表達率(±s,n=10)Table 3 Positive expression rate of CaM in cochlea nucleus of rats in each group(±s,n=10)

表3 各組大鼠耳蝸核組織CaM 陽性表達率(±s,n=10)Table 3 Positive expression rate of CaM in cochlea nucleus of rats in each group(±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1)CaM 陽性表達率/%對照 － 10.07±1.96模型 － 90.19±4.09a巖黃連 40 60.87±3.04ab 80 35.64±2.92bc 160 13.73±2.03bcd

圖2 各組大鼠CaM 免疫組化染色圖(×400)Fig.2 CAM immunohistochemical staining of rats in each group(× 400)

2.6 各組大鼠腦干組織p-PLC、IP3 蛋白表達量

與對照組相比，模型組大鼠腦干組織p-PLC、IP3 蛋白表達量降低（P＜0.05）；與模型組相比，巖黃連低、中、高劑量大鼠腦干組織p-PLC、IP3 蛋白表達量升高（P＜0.05），且巖黃連各劑量組大鼠腦干組織p-PLC、IP3 蛋白表達量呈劑量相關性，見圖3 和表4。

圖3 各組大鼠腦干組織p-PLC、IP3 蛋白表達免疫印跡圖Fig.3 Western blotting of p-PLC and IP3 protein expression in brain stem tissues of rats in each group

表4 各組大鼠腦干組織p-PLC、IP3蛋白表達量(±s,n=10)Table 4 Expression levels of p-PLC and IP3 protein in brain stem tissues of rats in each group(±s,n=10)

表4 各組大鼠腦干組織p-PLC、IP3蛋白表達量(±s,n=10)Table 4 Expression levels of p-PLC and IP3 protein in brain stem tissues of rats in each group(±s,n=10)

組別 劑量/(mg·kg-1)p-PLC/β-actin IP3/β-actin對照 － 1.06±0.13 1.07±0.11模型 － 0.15±0.10a 0.13±0.14a巖黃連 40 0.46±0.12ab 0.45±0.13ab 80 0.76±0.11abc 0.72±0.12aabc 160 1.02±0.10bcd 1.01±0.15bcd

3 討論

NH 是新生兒常見病癥，NH 并發腦病可在急性期導致新生兒死亡，即使患兒幸存也常遺留神經系統疾病，尤其以神經系統損傷最為常見[13]。目前對膽紅素的神經毒性如何作用于腦干聽覺核團導致聽力損傷的機制尚不明確[14]。腦干聽覺核團包括耳蝸核、上橄欖核復合體、外側丘系核和下丘，是聲音傳導的重要通路之一[15]。ABR 是應用于臨床的聽生理測試技術，可全面準確地記錄聲刺激后聽覺系統所產生的一系列電位反應，可以判斷聽力損傷發生的部位及程度[16]。膽紅素是水溶液中溶解度極低的極性分子，其陰離子可通過血腦屏障進入腦組織，并與神經細胞極性基團結合，并沉積在神經細胞膜，影響并抑制神經細胞能量代謝水平、神經末梢突觸膜去極化反應、神經對沖動反應而使神經元化學傳遞作用及神經的電傳導功能受損[17]。李克方[12]發現7 d 齡大鼠 ip 200 μg/g 的膽紅素24 h，可使大鼠血清和腦組織膽紅素含量增加，耳蝸核組織HE染色可見神經細胞損傷，免疫組化反應可見CaM 陽性表達增加，推測膽紅素沉積于耳蝸核的神經細胞突觸膜，使細胞膜Ca2+內流超載，Ca2+與CaM 結合后形成Ca2+-CaM 復合物，發揮毒性作用，導致耳蝸核信息的傳入功能受到影響及ABR 閾值升高、各波的潛伏期及聽覺傳導時間延長。本研究用200 μg/g 膽紅素ip 7 d 齡大鼠24 h 后發現，與對照組相比，模型組大鼠出現煩躁、翻滾、耳廓反射遲鈍或消失，對外界刺激反應遲鈍或無逃避反應，耳蝸核組織各亞核神經細胞體積腫脹、神經細胞數目及尼氏體減少、胞質內空泡較多等病理現象，ABR 反應閾明顯升高且I、II、III波潛伏期明顯延長，血清及腦干組織膽紅素含量升高，耳蝸核組織中CaM 陽性率增高[11]，提示造模成功。

NH 所致聽力神經損傷在早期具有可逆性，一旦發生不可逆的聽覺損傷，患兒只能用助聽器及耳蝸植入等方式進行治療，因此在NH 早期及時進行治療具有一定意義[18]。近來研究發現，巖黃連對NH 有較好的治療效果，可減輕NH 的程度和持續時間，劉馨燭等[19]發現巖黃連可促進膽汁轉運體表達，降低大鼠急性肝內膽汁瘀積，防止膽汁逆流入血，而出現血清膽紅素升高。本研究發現，與模型組相比，巖黃連低、中、高劑量組大鼠煩躁、翻滾、耳廓及對外界刺激反應遲鈍等現象明顯改善，耳蝸核組織病理損傷明顯減輕，ABR 反應閾降低且I、II、III波潛伏期縮短，血清及腦干組織膽紅素含量降低，耳蝸核組織CaM 陽性表達降低，且上述指標呈劑量相關性，表明巖黃連可降低新生NH 大鼠血清及腦組織膽紅素沉積，減少耳蝸核組織CaM 表達，緩解膽紅素對耳蝸核聽力神經系統的毒害作用。然而其具體分子機制還不甚明確。

Ca2+是神經系統正常活動和神經突觸傳導的重要信使，神經細胞內鈣超載，可誘導線粒體的氧化應激反應，并激活大量蛋白水解酶，導致大量神經元和少突角質細胞大量死亡[20]，可能是膽紅素沉積于耳蝸核的神經細胞突觸膜，使細胞膜Ca2+內流超載，是導致神經毒性的原因之一[11]。故促進胞內Ca2+釋放，抑制細胞內Ca2+超載引起的神經壞死，可能是緩解膽紅素對耳蝸核聽力神經系統的毒害作用的主要機制之一。而PLC/IP3 通路介導的內網鈣庫釋放，參與神經突觸間傳導和神經元可塑性調節，Melo 等[21]發現多巴胺受體可與G 蛋白偶聯并激活PLC，活化后的PLC 可促進IP3 的釋放，引起胞內內鈣釋放，發揮調節神經元生長、分化、生存的生理效應。劉斌等[22]發現在新生大鼠耳蝸血管紋緣細胞中，細胞外ATP 在無鈣離子的環境中，可以通過PLC-IP3 途徑觸發內質網鈣庫釋放，促進溶酶體的胞吐作用，從而將ATP 以囊泡形式釋放到胞膜外，調節聲轉導、聽敏度、耳蝸內電位、耳蝸內環境穩定等神經信號傳導。Luo 等[7]發現褪黑素可激活 PLC/IP3/Ca2+途徑升高腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）水平，抵抗高膽紅素引起的海馬神經元凋亡和神經毒性作用，而PLC/IP3 通路阻滯劑可拮抗褪黑素對NH 所致神經毒性的抵抗作用。本研究發現，與對照組相比，模型組大鼠腦干組織中p-PLC、IP3 蛋白表達降低，提示NH 大鼠腦干組織PLC/IP3 通路被抑制，可能抑制胞內Ca2+釋放，導致胞內鈣超載引起神經毒性。而與模型組大鼠相比，巖黃連低、中、高劑量組p-PLC、IP3 蛋白表達呈劑量相關性升高，表明巖黃連可能通過激活PLC/IP3 通路，促進胞內鈣釋放，進而減輕膽紅素沉積引起的胞內鈣超載，改善腦干中神經損傷。

綜上所述，巖黃連可激活NH 大鼠耳蝸核組織PLC/IP3 通路蛋白表達，緩解膽紅素對耳蝸核聽力神經系統的損傷，可能為闡明巖黃連改善高膽紅素沉積所致聽力神經毒性作用機制提供一定參考，但高膽紅素沉積所致神經毒性機制復雜，可能涉及其他通路，巖黃連的具體生物學機制仍需深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突