基于Keap1/Nrf2通路介導的自噬探討紫草素對膀胱上皮癌BUC細胞化療敏感性的影響

張 輝，張 爽，劉揚帆，宋 菲，金成允

1.南陽市中心醫院 腫瘤內科，河南 南陽 473000

2.鄭州大學藥學院 研究室，河南 鄭州 450052

膀胱上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BUC）是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，發病率居泌尿系統惡性腫瘤第2 位，是膀胱癌常見類型，占膀胱癌患者總數的90%以上[1]。目前BUC 治療主要采用以順鉑為基礎的化療方案，但順鉑耐藥性導致BUC 化療敏感性低，治療效果不佳，患者2年生存率低[2-3]。因此，如何提高化療敏感性是目前BUC 治療中亟需解決的問題。紫草素是從天然紫草根部提取出的一種活性蒽醌衍生物，具有抗氧化、抗炎、免疫調節、抗腫瘤等作用[4-5]。近年來研究發現，紫草素對卵巢癌等多種癌細胞均具有抗增殖、提高順鉑敏感性的作用[6-7]。自噬是通過降解受損的細胞器、變性的蛋白質等將能量再利用的過程，是細胞對抗不良生長環境的一種保護機制，其發生可降低腫瘤細胞的化療敏感性[8]。Kelch 樣 ECH 相關蛋白 1（Kelch-like ECHassociated protein 1，Keap1）/核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）通路是機體消除有害物質損傷作用、維持氧化還原平衡的重要通路，可介導自噬反應[9-10]。本研究基于Keap1/Nrf2通路介導的自噬探討紫草素對BUC 細胞化療敏感性的影響，以期為臨床提高BUC 化療敏感性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人膀胱乳頭狀移行上皮癌細胞BIU-87（貨號HZ-Y1072）購自美國ATCC 細胞庫；順鉑（批號T1564，質量分數95%）購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；紫草素（批號QY-0022，質量分數≥98%）購自上海喬羽生物科技有限公司；胎牛血清（貨號FBS500-S）購自澳大利亞AusGeneX 公司；DMEM培養基（貨號KL-P0032）購自德國Merck/Sigma公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑（貨號11668019）購自美國 Invitrogen 公司；實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒（貨號K1002S）購自美國Promega 公司；negative control（NC）-Nrf2、hsa-Nrf2 mimic 及Nrf2、β-actin 引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；CCK-8 試劑（貨號CK-04）購自日本同仁化學研究所；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（貨號S0185）購自哈爾濱新海基因檢測有限公司；Keap1 抗體、Nrf2 抗體、GAPDH 抗體（貨號ab139729、ab89443、ab63817）購自Abcam 公司；微管相關蛋白 1 輕鏈 3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體（貨號FNab04716）購自武漢菲恩生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（貨號0295G-HRP）購自美國Santa公司；TY10GI2-2 培養箱購自美國Shellab 公司；MODEL550 酶標儀購自美國Bio-Rad 公司；ABI7500 熒光定量PCR 儀購自美國Applied Biosystems公司；BD FACSCanto II流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 BIU-87 細胞常規培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，并置于37 ℃、5%CO2恒溫飽和濕度培養箱內培養，傳代3 次，取生長狀態良好的對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 順鉑對 BIU-87 細胞增殖的影響 調整BIU-87 細胞密度為1.5×105個/mL，以每孔100 μL接種于96 孔培養板，給予不同質量濃度的順鉑（10、20、40、80、160 μg/mL）處理，培養48 h，加入CCK-8 試劑，避光培養2 h，用酶標儀測定波長450 nm 處的吸光度（A）。以未給予順鉑處理細胞為對照，計算細胞增殖抑制率。實驗重復6 次。

細胞增殖抑制率＝(A對照－A給藥)/A對照

1.2.3 紫草素對順鉑處理的BIU-87 細胞增殖的影響 調整BIU-87 細胞密度為1.5×105個/mL，以每孔100 μL 接種于96 孔培養板，在給予40 μg/mL 順鉑的基礎上給予不同濃度的紫草素（2、4、8、16、32 μmol/L）處理，培養48 h，加入CCK-8 試劑，避光培養2 h，用酶標儀測定波長450 nm 處的A值。以未給予紫草素處理細胞為對照，計算細胞增殖抑制率，實驗重復6 次。

1.2.4 qRT-PCR 法檢測轉染后BIU-87 細胞中Nrf2mRNA 表達情況 調整BIU-87 細胞密度為1.5×105個/mL，以每孔100 μL 接種于96 孔培養板，設置對照組、順鉑組（40 μg/mL）、紫草素組（40 μg/mL順鉑＋8 μmol/L 紫草素）和NC 組（轉染NC-Nrf2＋40 μg/mL 順鉑＋8 μmol/L 紫草素）、Nrf2 組（轉染hsa-Nrf2 mimic＋40 μg/mL 順鉑＋8 μmol/L 紫草素）。細胞培養48 h，收集細胞，使用TRIzol 試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，qRT-PCR 法檢測Nrf2mRNA 表達水平，內參基因為β-actin。反應程序：95 ℃、2 min，94 ℃、30 s，55 ℃、32 s，72 ℃、2 min，共循環 35 次。Nrf2上游引物：5’-ACGGGGCAGTCATGTACCA-3’，下游引物：5’-GTTGAAGAACTCCTCCTGCTTG-3’；內參β-actin上游引物：5’-CTGTGGCATCCACGAAACT-3’，下游引物：5’-GGACTCGTCATACTCCTGCTT-3’。Ct值為擴增產物的熒光信號達到臨界閾值時對應的循環數，相對表達量以2-ΔΔCt表示，實驗重復6 次。

1.2.5 CCK-8 法檢測各組BIU-87 細胞增殖情況調整BIU-87細胞密度為1.5×105個/mL，以每孔100 μL 接種于96 孔培養板，分組及給藥同“1.2.4”項。細胞培養48 h，加入CCK-8 試劑，避光培養2 h，用酶標儀測定波長450 nm 處的A值，計算細胞增殖抑制率，實驗重復6 次。

1.2.6 流式細胞儀檢測各組BIU-87 細胞凋亡情況調整BIU-87細胞密度為1.5×105個/mL，以每孔100 μL 接種于96 孔培養板，分組及給藥同“1.2.4”項。細胞培養48 h，收集細胞，胰酶消化，PBS 洗滌，用結合緩沖液將細胞濃度調整為1×106個/mL，按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，避光孵育1 h，用流式細胞儀測定細胞凋亡率，實驗重復6 次。

1.2.7 蛋白免疫印跡（Western blotting）法檢測各組BIU-87 細胞中Keap1/Nrf2 通路及自噬相關蛋白表達情況 調整BIU-87 細胞密度為1.5×105個/mL，以每孔2 mL 接種于6 孔培養板，分組及給藥同“1.2.4”項。細胞培養48 h，收集細胞，加蛋白裂解液，離心收集蛋白并定量，取50 μg 蛋白進行SDS-PAGE 電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入Keap1 抗體（1∶300）、Nrf2 抗體（1∶300）、LC3 抗體（1∶300）、GAPDH 抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗（辣根過氧化物酶標記，1∶2000），室溫孵育1 h，ECL 化學發光法顯色，曝光，Image J 軟件分析條帶灰度，實驗重復6 次。

1.3 統計學分析

應用SPSS 24.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料均以x±s表示，多組間比較進行單因素方差分析，兩兩比較行SNK-q檢驗。當P＜0.05 時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 順鉑對BIU-87 細胞增殖的影響

與對照組相比，10、20、40、80、160 μg/mL順鉑處理下BIU-87 細胞增殖抑制率均顯著升高（P＜0.05），半數抑制濃度（IC50）在20～40 μg/mL內，故后續實驗中順鉑處理質量濃度均采用40μg/mL。見圖1。

圖1 不同質量濃度順鉑處理下BIU-87 細胞增殖抑制率(x± s,n＝6)Fig.1 Proliferation inhibition rate of BIU-87 cells treated with different concentrations of cisplatin(±s,n=6)

2.2 不同濃度紫草素對順鉑處理下BIU-87 細胞增殖的影響

與對照組相比，2、4、8、16、32 μmol/L 紫草素聯合順鉑處理下BIU-87 細胞增殖抑制率均顯著升高（P＜0.05），IC50在4～8 μmol/L 內，故后續實驗紫草素處理濃度均采用8 μmol/L。見圖2。

圖2 不同濃度紫草素聯合順鉑處理下BIU-87 細胞增殖抑制率(±s,n=6)Fig.2 Proliferation inhibition rate of BIU-87 cells treated with cisplatin and shikonin at different concentrations(±s,n=6)

2.3 轉染后BIU-87 細胞Nrf2 mRNA 表達情況

紫草素組、NC 組BIU-87 細胞中Nrf2mRNA表達水平差異不具有統計學意義（P＞0.05）；與NC組相比，Nrf2 組BIU-87 細胞中Nrf2mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 轉染后BIU-87 細胞Nrf2 mRNA 表達水平(±s,n=6)Fig.3 Nrf2 mRNA expression level in BIU-87 cells after transfection(±s,n=6)

2.4 轉染后BIU-87 細胞增殖、凋亡情況

與對照組相比，順鉑組BIU-87 細胞增殖抑制率、凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與順鉑組相比，紫草素組BIU-87 細胞增殖抑制率、凋亡率顯著升高（P＜0.05）；紫草素組、NC 組BIU-87 細胞增殖抑制率、凋亡率差異不具有統計學意義（P＞0.05）；與NC 組相比，Nrf2 組BIU-87 細胞增殖抑制率、凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見圖4、5。

圖4 各組BIU-87 細胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of BIU-87 cells in each group

圖5 各組BIU-87 細胞增殖抑制率、凋亡率Fig.5 Proliferation inhibition rate and apoptosis rate of BIU-87 cells in each group

2.5 轉染后BIU-87細胞中Keap1/Nrf2通路相關蛋白表達情況

與對照組相比，順鉑組BIU-87 細胞中Keap1蛋白表達水平顯著降低，Nrf2 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與順鉑組相比，紫草素組BIU-87細胞中Keap1 蛋白表達水平顯著升高，Nrf2 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；紫草素組、NC 組BIU-87 細胞中Keap1、Nrf2 蛋白表達水平差異不具有統計學意義（P＞0.05）；與NC 組相比，Nrf2 組BIU-87 細胞中Keap1 蛋白表達水平顯著降低，Nrf2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組BIU-87 細胞中Keap1、Nrf2 蛋白表達情況Fig.6 Expression of KEAP1 and Nrf2 protein in BIU-87 cells in each group

2.6 各組BIU-87 細胞中自噬相關蛋白表達情況

與對照組相比，順鉑組BIU-87 細胞中LC3I蛋白表達水平顯著降低，LC3II蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與順鉑組相比，紫草素組BIU-87細胞中LC3I蛋白表達水平顯著升高，LC3II蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；紫草素組、NC 組BIU-87 細胞中LC3I、LC3II蛋白表達水平差異不具有統計學意義（P＞0.05）；與NC 組相比，Nrf2 組BIU-87 細胞中LC3I蛋白表達水平顯著降低，LC3II蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組BIU-87 細胞中LC3?、LC3II 蛋白表達情況Fig.7 Expression of LC3? and LC3II protein in BIU-87 cells in each group

3 討論

化療是治療各種癌癥的重要手段之一，其療效經過長期廣泛地研究驗證，而腫瘤化療的敏感性與患者的預后及生存質量息息相關[11]。順鉑是BUC化療的一線基礎治療藥物，在使用過程中，BUC 易對順鉑產生耐藥性，導致化療敏感性不高，影響治療效果[12]。此外，BUC 作為一種具有復發傾向的惡性腫瘤，在接受多次、長期化療后，對化療藥物的敏感性也會逐漸降低，最終影響治療效果[13]。因此，尋找合適的治療藥物提高BUC 化療敏感性具有重要意義。本研究通過設置順鉑質量濃度梯度，發現BIU-87 細胞的順鉑IC50在20～40 μg/mL，故最終選定40 μg/mL 作為后續實驗中順鉑的處理濃度。

近年來，中藥在腫瘤治療中的作用越來越受到重視，許多抗腫瘤藥物均來自中藥提取物。紫草素是中藥紫草的主要活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、促進傷口愈合等一系列生物學特性[14-15]。目前，紫草素的抗腫瘤作用已在許多腫瘤中得到證實，其在腫瘤治療中的作用日益受到重視。Huang等[16]研究發現，紫草素能通過調節微小RNA-106b（miR-106b）/第10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源蛋白（phosphatase and tensin homolog gene deleted on chromosome 10，PTEN）/蛋白激酶B（protein kinaseb B，Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路抑制子宮內膜樣子宮內膜癌細胞的增殖并誘導其凋亡。Zhang 等[17]研究表明，紫草素類衍生物脫氧紫草素通過抑制Akt 信號介導的ATP 結合盒亞家族B成員1（ATP-binding cassette subfamily B member 1 transporter gene，ABCB1）表達來抑制NSCLC 細胞對順鉑的耐藥。Shilnikova 等[7]發現紫草素能誘導順鉑耐藥卵巢癌細胞凋亡。許靜等[18]研究表明，紫草素可以逆轉卵巢癌SKOV3/DDP 細胞的順鉑耐藥效應。本研究結果顯示，與單獨順鉑處理相比，使用2、4、8、16、32 μmol/L 紫草素均可進一步提高BIU-87 細胞的增殖抑制率，紫草素組BIU-87 細胞增殖抑制率、凋亡率較順鉑組均顯著升高，提示紫草素可以提高BIU-87 細胞的順鉑敏感性，但其作用機制還需進一步探究。

細胞自噬是維持細胞內環境穩態、生存的重要過程，利用溶酶體清除損傷、多余的蛋白質及細胞器并將能量供給自身再利用，在應激狀態時起重要的防御作用[19]。然而，腫瘤細胞也能利用該過程在化療中保護自身，影響化療敏感性。石瑛等[20]研究發現抑制自噬可增強乳腺癌MCF-7 細胞對紫杉醇的敏感性。張建育等[21]研究表明，二十碳五烯酸可能通過抑制自噬反應提高膀胱癌細胞的順鉑化療敏感性。殷雷等[22]研究發現，腫瘤抑制因子圓柱瘤基因CYLD能通過抑制自噬提高膀胱癌細胞對吉西他濱的化療敏感性。LC3 是自噬體膜上的標志性蛋白，在細胞質中以LC3I、LC3II 2 種形式存在，在自噬過程中由LC3I轉變為LC3II，進而與自噬體特異性結合[23]。本研究結果顯示，與對照組相比，順鉑組BIU-87 細胞中LC3II蛋白表達水平顯著升高，LC3I蛋白表達水平顯著降低，提示BIU-87 細胞在抵御順鉑作用時發生了自噬反應；與順鉑組相比，紫草素組BIU-87 細胞中LC3II蛋白表達水平顯著降低，LC3I蛋白表達水平顯著升高，提示紫草素可以通過抑制BIU-87 細胞的自噬反應，進而加強順鉑對細胞增殖的抑制作用及對細胞凋亡的促進作用。

Keap1/Nrf2 通路是調控機體氧化應激的重要通路。在正常生理狀態下，Keap1 和Nrf2 在細胞質內形成復合體，并介導泛素化持續降解Nrf2，以維持轉錄形成的Nrf2 之間的平衡。在應激條件下，Keap1中的半胱氨酸殘基發生修飾，導致Keap1 構象發生改變，Nrf2 從Keap1/Nrf2 復合物中分離且不會被泛素化和降解，通過影響多種自噬凋亡基因的轉錄參與自噬調節[24-25]。本研究結果顯示，與對照組相比，順鉑組BIU-87 細胞中Keap1 蛋白表達水平顯著降低，Nrf2 蛋白表達水平顯著升高，提示順鉑可激活Keap1/Nrf2 通路；與順鉑組相比，紫草素組BIU-87細胞中Keap1 蛋白表達水平顯著升高，Nrf2 蛋白表達水平顯著降低，提示紫草素可抑制Keap1/Nrf2 通路激活，推測紫草素可能通過影響Keap1/Nrf2 通路影響細胞自噬反應，進而影響BIU-87 細胞的順鉑敏感性。本研究在順鉑聯合紫草素處理基礎上，進一步通過轉染處理細胞上調Nrf2 表達，發現BIU-87細胞增殖抑制率、凋亡率顯著降低，細胞中Keap1、LC3I蛋白表達水平顯著降低，Nrf2、LC3II蛋白表達水平顯著升高，提示激活Keap1/Nrf2 通路后，BIU-87 細胞對順鉑的敏感性降低，細胞自噬反應增強，推測紫草素增強BIU-87 細胞的順鉑敏感性可能是通過抑制Keap1/Nrf2 通路激活，進而抑制自噬反應發揮作用的。

綜上所述，紫草素可以增強BUC 細胞BIU-87對順鉑的敏感性，可能是通過抑制Keap1/Nrf2通路介導的自噬反應發揮作用的。但本研究僅針對BIU-87 細胞，在其他BUC 細胞系中的作用還需在后續實驗中加以驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突