基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探究黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性的作用機制

夏亞飛，潘博宇，閻 姝*

1.天津市南開醫(yī)院 藥劑科，天津 300100

2.天津大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，天津 300100

外周神經(jīng)毒性是抗腫瘤藥物導致外周神經(jīng)功能紊亂表現(xiàn)的癥狀與化療所致的體征，患者常表現(xiàn)出對稱性、從肢體遠端開始的感覺異常、麻術(shù)、腱反射消失、肌肉痙攣甚至疼痛等臨床癥狀[1]。鉑類、紫杉醇類和長春堿類等化療藥物能夠?qū)е聬盒阅[瘤患者出現(xiàn)外周神經(jīng)毒性[2-3]。目前臨床常用維生素類、鼠神經(jīng)生長因子、核苷酸類、鈣劑、鎂劑、還原型谷胱甘肽等營養(yǎng)神經(jīng)類藥物治療化療引起的外周神經(jīng)毒性[4-7]。多數(shù)抗腫瘤藥物均可以引起外周神經(jīng)毒性，使患者生存質(zhì)量下降，化療引起的神經(jīng)毒性已成為抗腫瘤藥物劑量限制或停止使用的直接原因。因此，有效降低化療引起的神經(jīng)毒性是目前惡性腫瘤治療的重要問題。

傳統(tǒng)醫(yī)學并沒有“化療后外周神經(jīng)毒性”的相關(guān)記載，根據(jù)外周神經(jīng)毒性臨床表現(xiàn)出的四肢感覺異常、麻術(shù)疼痛、腱反射消失、肌肉痙攣等癥狀，可以將外周神經(jīng)毒性歸屬到中醫(yī)學的“血痹”“痹癥”“麻木”等范疇?！兜は姆ā氛J為，手足麻為氣虛所致，手足木則為痰濕血瘀所致；《素問·五臟生成》認為，血凝于膚即為痹。由此可見，對神經(jīng)病變的治療應(yīng)以補氣活血、逐瘀通絡(luò)為主。黃芪與桂枝相配有通經(jīng)絡(luò)、利血脈、止痹痛之效，為臨床常用的藥對。黃芪可補營衛(wèi)之氣、益營衛(wèi)之源，意為治血先治氣，氣行則血行，黃芪入脾肺，溫分肉，實營衛(wèi)，益氣固衛(wèi)、振奮陽氣；桂枝辛溫，具有辛能發(fā)散、溫陽助衛(wèi)、行營通痹之功效，協(xié)黃芪達表而運行氣血。現(xiàn)代藥理學研究表明，黃芪具有抗癌、增強造血功能的作用[8]；桂枝具有抗炎、抗凝血作用[9]；黃芪、桂枝可以擴張血管、改善末梢循環(huán)血供，從而促進肢體血液循環(huán)。

基于網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)分析的網(wǎng)絡(luò)藥理學，能以系統(tǒng)的方式揭示中藥及復方的潛在作用機制，從而為加快中藥現(xiàn)代化研發(fā)提供強有力的工具。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，對黃芪-桂枝藥對的潛在活性成分、作用靶點及相關(guān)信號通路進行分析，預測黃芪-桂枝藥對治療化療引起的神經(jīng)毒性的作用機制，以期為黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為復方制劑的開發(fā)提供指導。

1 材料與方法

1.1 黃芪與桂枝潛在活性成分的篩選及其作用靶點信息

通過傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）[10]檢索黃芪與桂枝的主要活性成分，根據(jù)吸收、分布、代謝和排泄（absorption，metabolism，distribution and excretion，ADME）相關(guān)參數(shù)進行篩選，設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18。通過文獻挖掘黃芪與桂枝中同時滿足以上條件的成分，匯總后得到黃芪與桂枝的主要活性成分。利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢主要活性成分對應(yīng)的靶點，并采用Uniprot在線數(shù)據(jù)庫查詢靶點對應(yīng)的基因名，選擇物種為“Homo sapiens”，建立數(shù)據(jù)集。將活性成分與對應(yīng)的靶點導入Cytoscape 3.2.1 軟件進行網(wǎng)絡(luò)關(guān)系可視化。

1.2 黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性潛在作用靶點的預測

檢索GeneCards 在線數(shù)據(jù)庫，以“neurotoxicity of chemotherapy”為關(guān)鍵詞，獲得與化療引起的神經(jīng)毒性相關(guān)靶點的數(shù)據(jù)集。使用TBtools 軟件“Wonderful Venn”功能，提取藥物與疾病交集靶點作為黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性潛在作用靶點。

1.3 黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性潛在作用靶點與其對應(yīng)的潛在活性成分導入Cytoscape 3.2.1 軟件，構(gòu)建黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性潛在作用靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction network，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性潛在作用靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”，置信度設(shè)為0.700，下載PPI 結(jié)果；導入Cytoscape 3.2.1 軟件進行PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化。采用CytoNCA 插件篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點，并利用Network Analyzer 計算核心靶點的度值。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

使用DAVID 在線分析平臺對核心靶點進行GO功能和KEGG 通路富集分析，設(shè)置P＜0.05，采用OmicShare 云平臺進行可視化作圖。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-桂枝藥對潛在活性成分的篩選及其作用靶點的收集

如表1所示，共篩選得到黃芪-桂枝藥對潛在活性成分38 個，其中黃芪24 個、桂枝14 個。黃芪-桂枝藥對潛在活性成分與靶點網(wǎng)絡(luò)見圖1，黃芪對應(yīng)377 個靶點，桂枝對應(yīng)142 個靶點，合并去掉重復后，黃芪-桂枝藥對共含442 個靶點。

表1 黃芪-桂枝藥對潛在活性成分Table 1 Potential active ingredients of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus

圖1 黃芪-桂枝藥對潛在活性成分與靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Network of potential active compounds and targets of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus

2.2 黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性作用靶點

如圖2所示，共檢索得到化療引起的神經(jīng)毒性相關(guān)靶點1543 個，黃芪-桂枝藥對防治化療引起神經(jīng)毒性的潛在作用靶點242 個。

圖2 黃芪-桂枝藥對活性成分作用靶點與化療引起的神經(jīng)毒性靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of targets of active ingredients of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus and neurotoxic targets caused by chemotherapy

2.3 黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性潛在作用靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將242 個黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性的潛在作用靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，由于有13 個潛在作用靶點與其他靶點之間不存在相互作用關(guān)系，最終得到229 個潛在作用靶點參與的PPI網(wǎng)絡(luò)，含229個節(jié)點、2207條邊。采用Cytoscape 3.2.1軟件中CytoNCA 插件篩選出度值＞30 的潛在核心靶點46 個，核心子網(wǎng)絡(luò)見圖3，含46 個節(jié)點、599條邊。節(jié)點分別代表潛在作用靶點，節(jié)點大小與顏色代表靶點的度值，節(jié)點越大、顏色越深，表明靶點在網(wǎng)絡(luò)體系中的度值越大；節(jié)點間連線表示靶點間存在潛在的相互作用關(guān)系。

圖3 黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性潛在作用靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of potential targets of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus for preventing and treating neurotoxicity caused by chemotherapy

2.4 黃芪-桂枝藥對活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將46 個潛在核心靶點及其對應(yīng)的29 個活性成分輸入Cytoscape 3.2.1軟件，構(gòu)建黃芪-桂枝藥對“活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)見圖4，菱形代表黃芪-桂枝藥對潛在活性成分，圓形代表潛在核心靶點，節(jié)點間的連線代表二者間的對應(yīng)關(guān)系，連線越多的活性成分或靶點代表其在網(wǎng)絡(luò)中的作用越關(guān)鍵。

圖4 “活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig.4 “Active ingredient-target-disease” network

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

對46 個潛在核心靶點分別進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，選取P＜0.05 且排名前10的條目，生物過程（biological process，BP）富集結(jié)果見圖5，黃芪-桂枝藥對防治神經(jīng)毒性可能與影響基因轉(zhuǎn)錄與表達、針對細胞凋亡的負面調(diào)控（即抑制凋亡）、針對藥物反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導、促進細胞增殖、調(diào)節(jié)一氧化氮（nitric oxide，NO）生物合成過程等過程密切相關(guān)。分子功能（molecular function，MF）富集結(jié)果見圖6，黃芪-桂枝藥對防治神經(jīng)毒性可能與影響蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA結(jié)合、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合、染色體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子的活性及DNA 序列的特異性結(jié)合、絲裂素活化的蛋白激酶活性等功能密切相關(guān)。KEGG 通路富集結(jié)果見圖7，黃芪-桂枝藥對防治神經(jīng)毒性可能與影響腫瘤相關(guān)通路、乙型肝炎相關(guān)通路、磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide-3 kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信號通路、甲型流感病相關(guān)信號通路、缺氧誘導因子信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）通路、人嗜T-淋巴病毒1 型（human T-cell lymphoma-leukemia virus-1，HTLV-1）感染疾病相關(guān)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、Toll 樣受體信號通路等密切相關(guān)。

圖5 黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性潛在核心靶點的GO-BP 富集分析(前10)Fig.5 GO-BP enrichment analysis of potential core targets of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus on preventing and treating neurotoxicity caused by chemotherapy(top 10)

圖6 黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性潛在核心靶點的GO-MF 富集分析(前10)Fig.6 GO-BP enrichment analysis of potential core targets of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus on preventing and treating neurotoxicity caused by chemotherapy(top 10)

圖7 黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性潛在核心靶點的KEGG 通路富集分析(前10)Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis of potential core targets of Astragali Radix and Cinnamomi Ramulus on preventing and treating neurotoxicity caused by chemotherapy(top 10)

3 討論

惡性腫瘤已成為全球性的多發(fā)疾病，化療、放療、手術(shù)治療為惡性腫瘤常用的治療手段[11-12]。奧沙利鉑[13]是胃腸道惡性腫瘤化療的一線用藥，與其他鉑類藥物相比，其骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)較輕，且對心腎無影響，但神經(jīng)毒性較明顯。奧沙利鉑誘導的癌性神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病率高且病程持續(xù)時間長，嚴重影響患者生活質(zhì)量及化療的連續(xù)性[14-16]。目前西醫(yī)多采用維生素、硫辛酸、腺苷鈷胺、甲鈷胺等治療化療后繼發(fā)性的神經(jīng)毒性，但療效一般。外周神經(jīng)毒性歸屬于中醫(yī)學中“血痹”“痹癥”“麻木”等范疇，臨床治療以補氣活血、化瘀通痹、益氣養(yǎng)陰為主要原則[17-18]。黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》，由黃芪、桂枝、芍藥、生姜、大棗5 味中藥配伍而成，其中黃芪補氣固表、托毒排膿，桂枝發(fā)汗解表、散寒止痛，芍藥鎮(zhèn)痙通經(jīng)，生姜溫中止嘔、解表散寒，大棗補脾和胃、益氣生津，全方具有益氣溫經(jīng)、和血通痹的功效。肢體血流量減少、局部血液循環(huán)障礙、肌肉失養(yǎng)均可導致肢體麻木，黃芪、桂枝可以擴張血管以改善末梢血供，從而調(diào)整和促進肢體血液循環(huán)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法合并文獻挖掘，共篩選得到黃芪-桂枝藥對潛在活性成分38 個，其中MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山柰酚）、MOL000401（黃芪皂苷I）、MOL000403（黃芪皂苷II）、MOL000398（二氫異黃酮）、MOL000392（刺芒柄花素）、MOL004576（花旗松素）對應(yīng)疾病靶點的數(shù)目較多。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以有效緩解中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，對腦缺血、阿爾茨海默病、帕金森病等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病均有一定的防治作用[19]；槲皮素具有抗炎、抗癌、抗氧化、改善內(nèi)皮功能、防止血小板聚集、提高人體免疫力等作用[20-22]。山柰酚對多種損傷組織均具有保護作用，山柰酚可以降低慢性低灌注大鼠腦額葉膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達，抑制β-淀粉樣前體蛋白表達及在胼胝體的聚集，從而發(fā)揮對慢性腦缺血星形膠質(zhì)細胞和軸突的保護作用[23]。黃芪總皂苷能夠明顯改善腦出血后腦水腫大鼠模型神經(jīng)功能，下調(diào)B 淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2），上調(diào)Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）及其下游半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3），從而發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡、保護神經(jīng)的作用[24]。芒柄花素具有抗腫瘤、調(diào)血脂、抗心律不齊、抗菌、解痙攣、抗脂質(zhì)過氧化等作用，能夠改善動脈粥樣硬化病變[25-26]。由此可見，黃芪-桂枝對化療引起的神經(jīng)毒性具有潛在的防治作用。黃芪主要含皂苷類、黃酮類和多糖類成分，具有增強心肌收縮力、抗心律失常、降血壓、降低血小板黏附力、減少血栓形成、調(diào)血脂、抗衰老等作用；桂枝主要含有機酸類和揮發(fā)油類成分，具有健胃、緩解胃腸道痙攣、利尿強心、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抑制驚厥等作用?！盎钚猿煞?靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)顯示黃芪-桂枝藥對防治化療引起的神經(jīng)毒性具有多成分、多靶點的特點。

本研究篩選得到與藥物治療疾病密切相關(guān)的46 個潛在核心靶點，分別為腫瘤抗原p53（tumor antigen p53，TP53）、AKT1、MAPK1、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、MAPK8、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）等。上述核心靶點與腫瘤相關(guān)信號通路聯(lián)系密切，其中最典型核心靶點為TP53、AKT1。損傷性因子和谷氨酸鹽誘導的神經(jīng)元死亡與TP53的表達有關(guān)[27-28]；TP53 在缺血和興奮性損傷誘導的神經(jīng)元細胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[29]。AKT1是P13K/AKT 通路的重要組成部分，在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK-1）的輔助下，P13K 磷酸化AKT 蛋白的Thr308 和Ser473 位點，活化的AKT通過上調(diào)細胞周期蛋白1（Cyclin D1）、磷酸化p21和p27 等蛋白表達，促進細胞增殖，并抑制細胞凋亡[30-31]。因此，黃芪-桂枝藥對可能通過調(diào)控TP53和AKT1 來防治化療引起的神經(jīng)毒性。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)理論，發(fā)現(xiàn)黃芪-桂枝藥對能夠通過影響基因轉(zhuǎn)錄與表達、促進細胞增殖等過程，作用于腫瘤相關(guān)通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路等防治化療引起的神經(jīng)毒性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突