基于超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學的甘棗寧治療非酒精性脂肪性肝病藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

王婉先，姚 曼，余 欽，李一璇，凌昌全,*

1.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203

2.海軍軍醫(yī)大學中醫(yī)系，上海 200433

3.海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院 中醫(yī)腫瘤科，上海 200433

4.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽醫(yī)院，上海 200437

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)病率日益升高，已成為最常見的慢性肝臟疾病之一[1]。海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院中醫(yī)科研發(fā)的甘棗寧復方由大棗、山藥、山楂、佛手、荷葉、玉米須6 味中藥組成，具有疏肝、健脾、調(diào)脂的功效，對NAFLD 療效顯著[2-3]。前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，甘棗寧治療NAFLD 具有多成分、多靶點、多通路的特點，涉及對營養(yǎng)物質(zhì)水平的調(diào)節(jié)、抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的激活、調(diào)控活性氧代謝等生物學過程。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)庫主要基于文獻報道，在藥材炮制過程中，其所含化學成分與原飲片可能存在差異[5]。因此，本研究以超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）鑒定數(shù)據(jù)為依據(jù)，進行網(wǎng)絡(luò)藥理學分析，并考察甘棗寧關(guān)鍵活性成分的抗炎作用，為系統(tǒng)分析甘棗寧治療NAFLD 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 飲片

大棗（批號200214-1）、山藥（批號200505-1）、山楂（批號200417-1）、佛手（批號200417-1）、荷葉（批號200320-1）購自安國市同德中藥材有限公司，玉米須（批號570180701）購自北京宏濟藥業(yè)有限公司，經(jīng)中國科學院大連化學物理研究所楊小平副研究員鑒定分別為鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實、薯蕷科植物薯蕷Dioscorea oppositaThunb.的干燥根莖、薔薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟果實、蕓香科植物佛手Citrus medicaL.var.sarco-dactylisSwingle 的干燥果實、睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥葉、禾本科植物玉蜀黍Zea maysL.的干燥花柱和柱頭。

1.3 藥品與試劑

對照品(S)-N-衡州烏藥堿、(R)-N-衡州烏藥堿、N-去甲基亞美罌粟堿、O-去甲基荷葉堿、(-)-表兒茶素和N-去甲基荷葉堿為本實驗室自制，經(jīng)HPLC檢測質(zhì)量分數(shù)均≥98%；質(zhì)譜級乙腈（批號203500）和甲酸（批號202674）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；DMEM 培養(yǎng)基（批號8120423）購自美國Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號ST1276）、一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（批號11020201014）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；青霉素-鏈霉素溶液（批號1936917）、PBS 緩沖液（批號2026067）購自以色列BI 公司；胎牛血清（批號ST180125）購自德國PAN-Biotech 公司；LPS（批號L6529）購自美國Sigma 公司；小白菊內(nèi)酯（批號I1206051）購自阿拉丁生化科技股份公司。

1.4 儀器

Acquity UPLC?I-Class 系統(tǒng)（美國Waters 公司）；1290 Infinity II UPLC、6545 Q-TOF-MS/MS（美國Agilent 公司）；BWS-27 型精密恒溫水槽（上海一恒科學儀器有限公司）；L550 型臺式離心機（上海盧湘儀有限公司）；311 型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；EnSight 酶標儀（美國PerkinElmer 公司）；HYC-290 型醫(yī)用冷藏箱（青島海爾特種電器有限公司）。

2 方法

2.1 甘棗寧水煎液的制備

稱取大棗飲片240 g、山藥飲片240 g、山楂飲片180 g、佛手飲片180 g、荷葉飲片120 g、玉米須飲片120 g，加入8 L 純水，浸泡30 min，100 ℃煎煮30 min，收集水煎液；加入8 L 純水，100 ℃煎煮20 min；合并2 次水煎液，過500 nm 陶瓷膜澄清，在進膜壓0.33 MPa、出膜壓0.26 MPa 的條件下進行澄清濾過，少量多次補水，收集透過液與截留液。將上述澄清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮成相對密度為1.0～1.2 的浸膏，于真空干燥箱中干燥。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品(S)-N-衡州烏藥堿、(R)-N-衡州烏藥堿、N-去甲基亞美（杏黃）罌粟堿、O-去甲基荷葉堿、(-)-表兒茶素、N-去甲基荷葉堿適量，溶于DMSO 分別配制成100 mmol/L 對照品溶液。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析

2.3.1 色譜條件 BEH Shield RP18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～15 min，2%～90%B；體積流量為0.4 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為1 μL。

2.3.2 梯度洗脫程序優(yōu)化 在BEH Shield RP18色譜柱上調(diào)整梯度洗脫程序，優(yōu)化對甘棗寧水煎液的分離效果。梯度1：0～15 min，2%～90% B。梯度2：0～9 min，2%～40% B；9～10 min，40%～0% B。梯度3：0～2 min，0% B；2～10 min，0%～40% B；10～12 min，40%～90% B。梯度4：0～2 min，0%B；2～4 min，0%～10% B；4～13 min，10%～35%B；13～15 min，35%～90% B。

2.3.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正、負離子全掃描模式；干燥氣溫度為320 ℃；干燥氣體積流量為8 L/min；霧化氣壓力為35 psi（1 psi＝6.895 kPa）；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣體積流量為11 L/min；毛細管電壓為＋3500 V 和-3000 V；碎裂電壓為135 V；碰撞電壓為65 V；碰撞能為20 eV；一級質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1300，二級質(zhì)量掃描范圍為m/z50 ～1000 ； 數(shù)據(jù)采集模式為Auto-MS/MS。

2.3.4 化學成分鑒定 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS對甘棗寧水煎液進行分析，比較甘棗寧水煎液在正負離子模式下的提取離子流圖，利用高分辨質(zhì)譜的精確相對分子質(zhì)量信息，確認化合物的分子式，隨后利用二級質(zhì)譜的碎片信息，結(jié)合文獻報道的裂解規(guī)律對化合物結(jié)構(gòu)進行推測，最后與文獻中的化合物碎片信息比對確認。

2.4 甘棗寧提取液中活性成分及疾病靶點的篩選

采用TCMSP 平臺（https://tcmspw.com/tcmsp.php）[6]對甘棗寧水煎液鑒定出的化合物逐一進行靶點檢索。以“NAFLD”作為關(guān)鍵詞，通過OMIM平臺（https://www.omim.org）、DisGeNET 平臺（https://www.disgenet.org/）[7]、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）[8]檢索NAFLD 相關(guān)靶點。DisGeNET 數(shù)據(jù)庫納入系統(tǒng)評分＞0.01 的靶點，GeneCards 數(shù)據(jù)庫納入系統(tǒng)評分＞45.475 的靶點，將各數(shù)據(jù)庫靶點合并去重，名稱格式統(tǒng)一，獲得交集基因數(shù)據(jù)集。

2.5 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選

采用STRING 數(shù)據(jù)庫[9]對甘棗寧潛在靶點與疾病靶點進行PPI 分析，上傳交集基因數(shù)據(jù)集，選擇物種為“Homo sapiens”，隱藏游離節(jié)點，采用Cytoscape 3.6.1 軟件[10]繪圖。

2.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

采用Metascape 數(shù)據(jù)庫對交集基因進行GO 分析和KEGG 分析[11]，將所得結(jié)果進行繪圖分析。采用Cytoscape 3.6.1 軟件ClueGo 插件[12]，錄入潛在靶點和疾病潛在相關(guān)靶點交集，進行GO 分析，得出生物過程（biological process，BP），選擇物種為“Homo sapiens”，選擇合并相似功能，統(tǒng)計P＜0.05 的通路，GO 網(wǎng)絡(luò)連接評分選擇0.45，繪制關(guān)鍵BP 富集圖，將關(guān)鍵靶點與之聯(lián)系，并根據(jù)占比情況繪制餅狀圖。

2.7 甘棗寧水煎液對RAW264.7 細胞上清液中NO水平的影響

取處于對數(shù)生長期的 RAW264.7 細胞，以2×104/孔接種至96 孔板中，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組、模型組、小白菊內(nèi)酯（5 μmol/L）組、(S)-N-衡州烏藥堿（100 μmol/L）組、(R)-N-衡州烏藥堿（100 μmol/L）組、N-去甲基亞美罌粟堿（100 μmol/L）組、O-去甲基荷葉堿（100 μmol/L）組、(-)-表兒茶素（100 μmol/L）組、N-去甲基荷葉堿（100 μmol/L）組和甘棗寧水煎液（2.5 mg/mL）組?！?.2”項下各對照品溶液分別用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度；“2.1”項下甘棗寧水煎液樣品用水配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的儲存液，用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。各給藥組加入90 μL 相應(yīng)藥物，預(yù)處理1 h；模型組和各給藥組再加入10 μL LPS（1 μg/mL），對照組加入含DMSO 的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，按試劑盒說明書檢測細胞上清液中NO 水平。

2.8 甘棗寧水煎液對RAW264.7 細胞存活率的影響

設(shè)置對照組、N-去甲基荷葉堿（200、100、50 μmol/L）組和甘棗寧水煎液（10.0、5.0、2.5 mg/mL）組。按“2.7”項下方法處理細胞，棄去培養(yǎng)基，避光加入100 μL CCK8 溶液，培養(yǎng)1 h，采用酶標儀測定450 nm 處吸光度（A）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝A給藥/A對照

3 結(jié)果

3.1 甘棗寧水煎液中化學成分的鑒定

通過梯度條件的優(yōu)化，確定了最佳的流動相條件為梯度4，在質(zhì)譜分析時為了確認樣品在色譜柱上的殘留情況，增加了5 min 90% B 沖洗時間。甘棗寧水煎液的提取離子流圖見圖1，甘棗寧水煎液在正離子模式下的響應(yīng)優(yōu)于負離子模式，正負離子模式下的離子化效率不同。通過對正負離子模式的成分解析，共獲得96 個主峰化合物，包括野漆樹苷、山柰素-3-O-己糖苷、金絲桃苷和香葉木素-7-O-葡萄糖苷等34 個黃酮類化合物，以及氨基酸類、單糖類、酚酸類、核苷類、花青素類、檸檬苦素類、生物堿類、有機酸類化合物。

圖1 甘棗寧水煎液在正離子模式(A)和負離子模式(B)下的提取離子流圖Fig.1 Extraction ion chromatogram of Ganzaoning Decoction in positive ion mode(A)and negative ion mode(B)

3.2 甘棗寧治療NAFLD 的網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

續(xù)表1

預(yù)測出的31 個活性成分見表1。如圖2所示，甘棗寧治療NAFLD 共42 個靶點，“中藥-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)見圖3。如圖4所示，PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得出白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、趨化因子配體 2（chemokine C-C motif ligand 2，CCL2）、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）等靶點相關(guān)性較強。

表1 甘棗寧活性成分Table 1 Active compounds of Ganzaoning

圖2 甘棗寧治療NAFLD 的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of Ganzaoning in treatment of NAFLD

圖3 “中藥-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.3 “Traditional Chinese medicine-ingredient-target-pathway” network

圖4 甘棗寧治療NAFLD 的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of Ganzaoning in treatment of NAFLD

如圖5所示，甘棗寧治療NAFLD 主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）及其糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）通路、血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、程序性壞死等通路。如圖6所示，甘棗寧治療NAFLD 涉及外源性凋亡信號通路、細胞對LPS反應(yīng)、細胞對活性氧的反應(yīng)等20 個BP 條目，神經(jīng)元胞體、真空裂解、內(nèi)吞小泡等6 個細胞組成（cellular component，CC）條目，核受體活性、蛋白酶結(jié)合、轉(zhuǎn)氨酶活性等10 個分子功能（molecular function，MF）條目。ClueGO 進一步對BP 富集進行分析見圖7，NOS3 處于核心位置，與細胞對LPS的反應(yīng)密切相關(guān)。

圖6 甘棗寧治療NAFLD 的GO 分析Fig.6 GO analysis of Ganzaoning in treatment of NAFLD

圖7 ClueGO BP 富集分析Fig.7 ClueGO biological process enrichment analysis

3.3 甘棗寧水煎液對RAW264.7 細胞上清液中NO水平的影響

如圖8所示，與對照組比較，模型組細胞上清液中NO 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，小白菊內(nèi)酯、(S)-N-衡州烏藥堿、O-去甲基荷葉堿、(-)-表兒茶素、N-去甲基荷葉堿和甘棗寧水煎液組細胞上清液中NO 水平均顯著降低（P＜0.001），表明(S)-N-衡州烏藥堿、O-去甲基荷葉堿、(-)-表兒茶素和N-去甲基荷葉堿是甘棗寧抗炎的重要藥效成分，其中N-去甲基荷葉堿抗炎活性最強。

圖8 甘棗寧水煎液對RAW264.7 細胞上清液中NO 水平的影響Fig.8 Effect of Ganzaoning Decoction on NO level in supernatant of RAW264.7 cells

對N-去甲基荷葉堿和甘棗寧水煎液進行抗炎活性劑量檢測，如圖9所示，從劑量效應(yīng)曲線計算獲得N-去甲基荷葉堿的IC50值為（105.41±12.08）μmol/L，甘棗寧水煎液的IC50值為（703.80±120.35）μg/mL。

圖9 不同劑量N-去甲基荷葉堿和甘棗寧水煎液對RAW264.7 細胞上清液中NO 水平的影響Fig.9 Effect of N-nornuciferine and Ganzaoning Decoction with different concentrations on NO level in supernatant of RAW264.7 cells

3.4 甘棗寧水煎液對RAW264.7 細胞存活率的影響

如圖10所示，與對照組比較，N-去甲基荷葉堿（200、100 μmol/L）組細胞存活率顯著降低（P＜0.01、0.001），各劑量甘棗寧水煎液均無細胞毒性，表明甘棗寧具有較好的安全劑量范圍，符合藥食同源的特征。

圖10 N-去甲基荷葉堿和甘棗寧水煎液對RAW264.7 細胞存活率的影響Fig.10 Effect of N-nornuciferine and Ganzaoning Decoction on survival rate of RAW264.7 cells

4 討論

中草藥調(diào)脂具有明顯優(yōu)勢[13]。甘棗寧能夠顯著改善NAFLD 患者血脂水平，經(jīng)甘棗寧顆粒干預(yù)后的脂肪肝患者的中醫(yī)證候積分明顯低于對照組，肝功能及血脂指標改善顯著大于對照組[2-3]；甘棗寧顯著改善大鼠肝組織脂肪變性[14]。目前針對甘棗寧的相關(guān)成分鑒定與藥效基礎(chǔ)研究尚淺，本研究以UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)分析出甘棗寧所含468個化學成分，鑒定了96 個化學成分，較此前單純依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)庫得到的84 個成分，更加豐富全面。金絲桃苷對抗化學損害、抗病毒、抑制自由基脂質(zhì)過氧化、保肝護肝等具有顯著作用[15-16]；異牡荊素可通過抑制炎性反應(yīng)和氧化反應(yīng)來防御LPS/D-半乳糖胺誘導的肝損傷[17]；荷葉生物堿類化合物具有良好的抗炎[18]、調(diào)脂，抑制前脂肪細胞增殖的功能[19]，可以顯著抑制參與多種內(nèi)源物和外源物代謝的細胞色素P4502D6（cytochrome P4502D6，CYP2D6）酶[20]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學分析發(fā)現(xiàn)甘棗寧治療NAFLD 的活性成分主要來自荷葉、山楂、佛手和大棗，結(jié)合PPI分析發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF、PPARG、CCL2、NOS3 等靶點相關(guān)性較強。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD 形態(tài)學病變嚴重程度較高的III 類肥胖患者在肝臟等白色脂肪組織中表現(xiàn)出較高的IL-6 和TNF-α 表達[21]。脂肪變性的原代肝細胞以脂肪形成的特征釋放促炎細胞因子IL-6[22]。NAFLD 中核因子的改變與脂肪變性、氧化應(yīng)激和炎性介質(zhì)（如TNF-α、IL-6）有關(guān)[23]?；加蠳AFLD 的病態(tài)肥胖患者血清中TNF-α 水平顯著升高[24]。PPARG 是調(diào)節(jié)脂肪細胞分化、胰島素敏感性和脂質(zhì)代謝的核受體[25]。在NAFLD 發(fā)生期間，肝臟中CCL2 及其受體表達上調(diào)，促進巨噬細胞蓄積，從而發(fā)生炎性反應(yīng)、纖維化和脂肪變性[26]。

KEGG 富集分析甘棗寧治療NAFLD 主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 通路、癌癥、乙型肝炎、血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、程序性壞死等通路。AGEs-RAGE 軸參與肝損傷和NAFLD 的發(fā)病機制[27]。RAGE 途徑能夠調(diào)節(jié)肝損傷、炎性反應(yīng)和纖維化[28]。NAFLD 是非鈣化斑塊的獨立危險因素[29]。GO 分析發(fā)現(xiàn)甘棗寧治療NAFLD 涉及外源性凋亡信號通路、細胞對LPS 反應(yīng)、細胞對活性氧的反應(yīng)等BP 條目，神經(jīng)元胞體、真空裂解、內(nèi)吞小泡等CC 條目，核受體活性、蛋白酶結(jié)合、轉(zhuǎn)氨酶活性等MF 條目。NAFLD 的發(fā)生與LPS 水平升高有關(guān)，動物長期sc LPS 和高脂飲食可通過核因子-κB 抑制物激酶ε（nuclear factor-κB inhibitor kinase ε，IKKε）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號傳導誘發(fā)NAFLD[30]。線粒體的改變是導致NAFLD 的關(guān)鍵因素，β 氧化水平降低，脂肪生成的增加，會導致脂質(zhì)在肝細胞中的積累，隨后產(chǎn)生活性氧和肝細胞損傷，激活Kupffer 細胞和肝星狀細胞，從而促進肝臟炎性反應(yīng)和纖維化[31]。NAFLD 中核受體如PPAR、組成性雄甾烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）、孕烷X 受體（pregnane X receptor，PXR）、肝X 受體（liver X receptor，LXR）和法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）的失調(diào)可能影響肝臟中內(nèi)源性和外源性化學物質(zhì)的代謝[32]。

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 與網(wǎng)絡(luò)藥理學[33]結(jié)果，進一步考察甘棗寧及6 種荷葉生物堿的抗炎活性。NO 是一種脂溶性氣體物質(zhì)，在肝臟中存在典型的合成通路，能夠調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌舒張功能，增加通透性，促使細菌內(nèi)毒素入侵，與NAFLD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[34-35]。NO 由NOS 催化產(chǎn)生，在體內(nèi)表現(xiàn)為神經(jīng)型、誘導型和內(nèi)皮型，其中內(nèi)皮型NOS 能夠通過干預(yù)肝臟線粒體影響NAFLD 疾病進程[36]。ClueGO 分析發(fā)現(xiàn)，NOS3 處于核心位置，與細胞對LPS 的反應(yīng)密切相關(guān)。NOS3 是小鼠高脂喂養(yǎng)期間肝胰島素抵抗和高胰島素血癥發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，同時也是影響NF-κB 活化的關(guān)鍵因子[37]，與網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測結(jié)果一致，甘棗寧可能通過NOS3發(fā)揮治療NAFLD 的作用。

中醫(yī)藥治療肝臟疾病具有顯著療效[38]，在探索甘棗寧治療NAFLD 的作用機制過程中，面臨著中藥方劑多成分、多靶點的難點。本研究通過UPLC-Q-TOF-MS/MS 與網(wǎng)絡(luò)藥理學明確物質(zhì)基礎(chǔ)，再通過體外實驗驗證，與臨床實踐互相印證，探討了甘棗寧治療NAFLD 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，后續(xù)研究需將證候、藥物配伍關(guān)系、量效等信息融入網(wǎng)絡(luò)藥理學[39]，完善數(shù)據(jù)庫信息，衡量結(jié)果的可靠性，為今后進一步挖掘方劑的有效性奠定基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突