銀花青蒿梔子方灌腸劑體內抗A6型柯薩奇病毒的作用及機制研究

李 菲，李 娟，張振杰，侯 林，崔清華，田景振*

1.山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）藥學院，新發傳染病病因流行病學重點實驗室，山東 泰安 271016

2.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355

A6 型柯薩奇病毒（coxsackievirus A6，CV-A6）屬于小核糖核酸病毒科的腸道病毒A 組，自2013年逐漸成為手足口病暴發流行的主要病原體之一[1-3]。CV-A6 不同于CV-A16 和71 型腸道病毒（enterovirus 71，EV71），后兩者P1 區序列相似度極高，靶受體、致病機制和抗病毒藥物等方面存在相同或相似之處[4]，EV-71 的相關研究為CV-A16 的研究和應對奠定了良好基礎，目前CV-A6 的相關研究較少[5]。

清熱解毒類中藥不僅能夠抗病毒、消炎、退熱，還能提高人體免疫力，治療病毒性感染疾病具有多靶點、整體調節的特點[6-7]。灌腸給藥具有良好的安全性和順應性，適合中藥發揮復方優勢[8]。銀花青蒿梔子方源于名老中醫經驗方，組方為金銀花3～15 g、青蒿6～25 g 和梔子3～12 g，具有清熱解毒、疏風解表的功效[9]。近年來，研究發現該方開發的中藥制劑對甲型H1N1 流感病毒、單純皰疹病毒、腺病毒及腸道病毒EV71 和CV-A16 等均有抑制作用[10-11]。基于課題組前期研究發現銀花青蒿梔子方具有抗CV-A6 作用，制備了銀花青蒿梔子方灌腸劑，本研究考察銀花青蒿梔子方灌腸劑體內抗CV-A6 的作用，并初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物

ICR 孕鼠16 只，8 周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號SCXK（京）2012-0001）。動物飼養于溫度（22±1）℃、濕度（55±5）%的環境中，自由進食飲水。動物實驗符合山東第一醫科大學動物實驗倫理學規定（批準號2018049）。

1.2 病毒和細胞

CV-A6引自中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所毒種室；人橫紋肌瘤細胞RD 引自中國預防醫學研究所病毒研究室。

1.3 藥材

金銀花（批號 20170306）、青蒿（批號20170306）、梔子（批號20170306）均購自泰安市金泰聯藥店，經山東第一醫科大學高洪莉教授鑒定分別為忍冬科忍冬屬植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾、菊科蒿屬植物黃花蒿Artemisia annuaL.的干燥地上部分、茜草科梔子屬植物梔子Gardenia jasminoidesElis 的干燥果實。

1.4 藥品與試劑

銀花青蒿梔子方灌腸劑（批號20170923）、多克隆抗體為本實驗室自制；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；qPCR 試劑盒（批號03907）購自天根生化科技有限公司；Trizol（批號1705263）購自美國 Invitrogen 公司；轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）ELISA 試劑盒（批號128170744）購自聯科生物；Procarta Plex多因子檢測試劑盒（批號148087012）購自美國eBioscience 公司；HRP 標記的羊抗鼠IgG 抗體（批號G1211）購自Servicebio 公司；Tunnel 試劑盒（批號11684817910）、DAPI（批號216276）購自瑞士Roche 公司；山羊血清（批號AR1009）購自博士德生物工程有限公司。

1.5 儀器

1300 A2 生物安全柜、371 型CO2恒溫培養箱、7500 Fast 熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；倒置顯微鏡（日本尼康株式會社）；Infinite M 200 Pro 酶標儀（瑞士Tecan 公司）；MAGPIX 液相芯片分析系統（美國Luminex 公司）；石蠟切片機、EMUC7 型超薄切片機（德國Leica公司）；JEM-1200EX Ⅱ型透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社）。

2 方法

2.1 銀花青蒿梔子方灌腸劑的制備

將金銀花、青蒿、梔子粉碎為粗粉，分別稱取上述藥材粗粉120、600、80 g，加入8 倍量55%乙醇浸泡2 h，超聲提取30 min，提取2 次，抽濾，合并濾液，40 ℃減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10；加入3%聚山梨酯-80 超聲分散均勻，加入3%水溶性氮酮和0.2%山梨酸鉀，以氫氧化鈉溶液調節pH 值至6.8，加入純化水至1 L，得到0.8 g/mL（以生藥量計）的褐色澄清灌腸劑。

2.2 造模、分組與給藥

10日齡ICR 乳鼠隨機分為對照組、模型組、銀花青蒿梔子方灌腸劑（2.6 g/kg）[11]組和利巴韋林（10 mg/kg）組，每組14 只。除對照組外，其余各組ip 0.1 mL CV-A6（滴度為107.4TCID50/mL）。銀花青蒿梔子方灌腸劑組感染后1 h 內灌腸25 μL 藥物，利巴韋林組im 藥物，模型組和對照組灌腸等體積純化水，2 次/d，連續14 d。第4 天各組隨機取4 只乳鼠，乙醚吸入麻醉后內眥取血，分離血清，-80 ℃保存，用于細胞因子測定；取心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織，-80 ℃保存，用于病毒載量測定。

2.3 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠血清中細胞因子水平的影響

按ELISA 試劑盒說明書測定血清中TGF-β 水平；按Procarta Plex 多因子檢測試劑盒說明書測定血清中白細胞介素-4（interleukin 4，IL-4）、IL-5、IL-6、IL-12 p70、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）水平。

2.4 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒載量的影響

取凍存的心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織，加入液氮研磨，按照試劑盒說明書提取各組織總RNA 并合成cDNA，進行qRT-PCR 分析。引物及探針序列：上游引物5’-CCTGAATGCGGCTAATCC-3’，下游引物5’-TTGTCACCATWAGCAGYCA-3’，探針5’-FAM-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-BHQ1-3’。

2.5 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠生存率和臨床評分的影響

每天觀察、記錄乳鼠的癥狀變化，統計生存率，按照文獻方法[12]對臨床癥狀進行評分。

2.6 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病理變化的影響

末次給藥3 h 后，各組其余動物脫頸椎處死，取心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織，于10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制備厚度為5 μm 的切片，進行HE 染色，于顯微鏡下觀察。

2.7 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠脊髓頸膨大段超微結構的影響

取脊髓頸膨大段，于2.5%戊二醛、1%四氧化鋨中固定，梯度乙醇脫水，環氧樹脂包埋，制備厚度為50～60 nm 超薄切片，進行醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，于TEM 下觀察。

2.8 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒抗原表達的影響

取心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織，以自制多克隆抗體[13]為一抗，HRP 標記的羊抗鼠IgG 抗體為二抗，進行免疫組織化學染色，于顯微鏡下觀察，采用Image J 軟件分析陽性區域的吸光度（A）值。

2.9 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠骨骼肌組織細胞凋亡的影響

取“2.6”項下骨骼肌石蠟切片，脫水后用組化筆畫圈，加入10%山羊血清，室溫封閉30 min；吸除血清，加入Tunnel 反應混合液，37 ℃孵育1 h；TBS 洗滌3 次，5 min/次；滴加DAPI 染色，避光室溫孵育10 min；TBS 洗滌，以抗熒光衰減封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察。

2.10 統計學處理

3 結果

3.1 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠血清中細胞因子水平的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組乳鼠血清中IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，銀花青蒿梔子方灌腸劑組乳鼠血清中IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β 水平均顯著降低（P＜0.01、0.001）。

圖1 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR 乳鼠血清中IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α、IFN-γ 和TGF-β 水平的影響Fig.1 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on levels of IL-5,IL-6,IL-12 p70,TNF-α,IFN-γand TGF-β in serum of CV-A6 infected ICR mice

3.2 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒載量的影響

如圖2所示，模型組乳鼠骨骼肌、延髓、脊髓、心臟和肺組織中的病毒載量均較高，其中骨骼肌組織的病毒載量最高；與模型組比較，銀花青蒿梔子方灌腸劑顯著降低了后肢肌、脊髓、延髓、心臟和肺組織的病毒載量（P＜0.05、0.01）。

圖2 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR 乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒載量的影響Fig.2 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral load in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice

3.3 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠生存率和臨床評分的影響

如圖3所示，10日齡ICR 乳鼠ip 感染CV-A6，5 d 后開始出現急性弛緩性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）的典型癥狀，14 d 后生存率為10%。銀花青蒿梔子方灌腸劑組較少出現AFP 癥狀，運動能力較正常，臨床評分低，給藥14 d 后生存率為70%，藥效優于利巴韋林。

圖3 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR 乳鼠生存率和臨床評分的影響Fig.3 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on survival rate and clinical score of CV-A6 infected ICR mice

3.4 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病理變化的影響

如圖4所示，與對照組相比，模型組乳鼠骨骼肌出現嚴重的肌纖維溶解、斷裂，肌束稀疏；脊髓前角和延髓中的神經元出現變性、壞死；心肌泡沫化，心肌纖維有輕度的溶解、斷裂；肺組織出現嚴重的纖維化。銀花青蒿梔子方灌腸劑組骨骼肌基本無肌束斷裂，肌纖維排列較為整齊；脊髓前角和延髓中的神經元壞死程度有一定改善；心肌無出血現象，心肌纖維排列較為整齊；肺纖維化程度明顯減輕，肺泡形態接近正常。

圖4 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR 乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病理變化的影響(HE,×200)Fig.4 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on pathological changes in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice(HE,× 200)

3.5 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠脊髓頸膨大段超微結構的影響

如圖5所示，對照組脊髓前角神經元細胞器豐富，在核周分布均勻，有豐富的粗面內質網平行排列，核糖體顆粒豐富，形成發育良好的尼氏體區域（圖5-A），髓鞘板層結構排列整齊（圖5-B），核內染色質均勻，核仁大而圓，線粒體呈橢圓形，嵴清晰（圖5-C）。模型組脊髓前角神經元細胞器數量明顯減少，粗面內質網擴張并有脫顆粒，核糖體顆粒分散，未形成尼氏體；核膜凹凸不平，核仁變小，異染色質在核邊緣聚集；胞質廣泛水腫，線粒體腫脹變形，基質稀疏，大部分嵴膜不清甚至消失，外膜膨脹隆起，形成空泡（圖5-D）；髓鞘板層結構紊亂，出現囊性間隙，中間有纖維填充（圖5-E）；呈現嗜神經現象（圖5-F）。銀花青蒿梔子方灌腸劑組脊髓前角神經元細胞接近正常，粗面內質網基本為平行狀排列，水腫減輕，游離核糖體減少，表明細胞合成功能旺盛，有利于神經軸突的修復（圖5-I）；線粒體形態較改善，數量增加（圖5-G）；髓鞘板層結構散亂和分離程度減輕（圖5-H）。利巴韋林組脊髓前角神經元細胞器粗面內質網逐漸恢復正常的平行狀排列，游離核糖體減少（圖5-J），線粒體形態較改善，異染色質在核邊緣聚集（圖5-L）；髓鞘板層結構散亂，中間有纖維填充（圖5-K）。

圖5 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR 乳鼠脊髓頸膨大段超微結構的影響(×10 000)Fig.5 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on ultrastructure of spinal cord slices in CV-A6 infected ICR mice(× 10 000)

3.6 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒抗原表達的影響

如圖6所示，病毒抗原在模型組乳鼠后肢骨骼肌中病毒表達最為嚴重，脊髓和延髓的神經元和膠質細胞有病毒抗原分布，病毒抗原在心臟中的分布相對較少，在肺組織中分布廣泛。與模型組相比，銀花青蒿梔子方灌腸劑組后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心臟和肺組織的陽性表達均減少。如表1所示，銀花青蒿梔子方灌腸劑組骨骼肌和肺組織病毒抗原表達明顯減少（P＜0.05）。

圖6 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR 乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒抗原表達的影響(×200)Fig.6 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral antigen expression in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice(× 200)

表1 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR 乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒抗原表達的影響Table 1 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral antigen expression in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata,and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice

表1 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR 乳鼠心臟、肺臟、脊髓、延髓和后肢骨骼肌組織病毒抗原表達的影響Table 1 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on viral antigen expression in heart,lungs,spinal cord,medulla oblongata,and hind limbs skeletal muscle tissue of CV-A6 infected ICR mice

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05#P <0.05 ##P <0.01 vs control group;*P <0.05 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1)A 值骨骼肌 脊髓 延髓 心臟 肺對照 — 0.09±0.02 0.09±0.01 0.09±0.00 0.09±0.01 0.09±0.01模型 — 0.21±0.04## 0.18±0.03## 0.16±0.03# 0.15±0.02# 0.19±0.04##利巴韋林 0.01 0.16±0.02 0.12±0.02 0.13±0.01 0.13±0.02 0.15±0.02銀花青蒿梔子方灌腸劑 2.60 0.15±0.01* 0.14±0.03 0.12±0.01 0.12±0.01 0.13±0.02*

3.7 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR乳鼠骨骼肌組織細胞凋亡的影響

如圖7所示，與對照組相比，模型組乳鼠骨骼肌凋亡細胞增多；與模型組相比，各給藥組乳鼠骨骼肌凋亡細胞減少，表明銀花青蒿梔子方灌腸劑對病毒導致的肌細胞凋亡具有抑制作用。

圖7 銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 感染的ICR 乳鼠骨骼肌組織細胞凋亡的影響(×200)Fig.7 Effect of Yinhua-Qinghao-Zhizi Enema on muscle cell apoptosis of CV-A6 infected ICR mice(× 200)

4 討論

手足口病典型臨床癥狀為發熱，手、口、足、臀等部位出疹，部分患兒出現無菌性腦膜炎、腦炎、AFP 等重癥表現[14]。ICR 乳鼠感染CV-A6 后出現的主要癥狀為AFP，銀花青蒿梔子方灌腸劑能夠提高病毒感染得乳鼠生存率，改善其臨床癥狀。ICR 乳鼠感染CV-A6 后多個組織臟器發生病理損傷，其中骨骼肌病理嚴重損傷、脊髓前角神經元壞死、延髓的錐體束受損與其癥狀表現主要為AFP 有一定的關聯性。銀花青蒿梔子方灌腸劑能夠減輕骨骼肌、脊髓、肺臟等組織的病理損傷，降低病毒抗原表達。ICR 乳鼠感染CV-A6 后骨骼肌、脊髓、延髓和肺組織中病毒載量高，與骨骼肌和脊髓是EV71 復制并傳播到腦組織的重要部位相似[15]；銀花青蒿梔子方灌腸劑顯著降低上述組織中的病毒載量，體現出良好的抗CV-A6 活性。

病毒侵犯脊髓前角灰白質區運動神經元，導致肌肉特別是肢體肌肉發生不對稱弛緩性麻痹。EV71感染的乳鼠骨骼肌細胞和Vero 細胞中線粒體空泡化，表明線粒體可能是其直接損傷靶點[16]。本研究發現CV-A6 感染導致脊髓組織的超微結構發生明顯改變，如前角神經元線粒體發生腫脹變形、形成空泡等；銀花青蒿梔子方灌腸劑組脊髓組織神經元細胞的形態結構趨于正常，表明銀花青蒿梔子方灌腸劑對CV-A6 致神經元細胞結構損傷有改善作用。

病毒感染可以通過多個信號通路觸發宿主細胞凋亡，凋亡的發生可以促進病毒和炎性細胞因子的釋放，是病毒感染導致臨床病癥和病理改變的原因之一[4,17]。EV71 和CV-A16 均通過半胱氨酸蛋白酶（Caspase）途徑誘導宿主細胞凋亡[18-19]。本研究結果顯示，銀花青蒿梔子方灌腸劑能夠抑制CV-A6 致骨骼肌細胞凋亡，從而抑制病毒和炎性細胞因子的釋放，減輕病毒感染導致的癥狀和病理損傷，發揮抗病毒作用。

病毒感染可以過度激活機體免疫系統，引發機體產生細胞因子風暴[20-21]，細胞因子風暴導致局部與全身的炎性反應，造成組織損傷、器官功能的喪失甚至死亡[22]。人感染登革病毒后，血清中IL-8、IFN-γ、TGF-β 和IL-10 水平升高[23]；Balb/c 小鼠感染CV-B3 后，血清中IL-6、IL-12（p40）、IL-12（p70）、IL-17α、IFN-γ、TNF-α 水平均顯著升高[24]。本研究結果顯示，CV-A6 感染導致ICR 乳鼠血清中多種細胞因子水平顯著升高，與文獻結果一致[25]；與模型組比較，銀花青蒿梔子方灌腸劑顯著降低血清中TGF-β、IL-5、IL-6、IL-12 p70、TNF-α 和IFN-γ 水平，從而減輕細胞因子風暴導致的炎性損傷，發揮抗病毒作用。

綜上，本研究發現銀花青蒿梔子方灌腸劑具有良好的抗CV-A6 作用，能夠提高CV-A6 感染的ICR乳鼠生存率并改善臨床癥狀，可能與其減少脊髓前角神經元細胞結構損傷、抑制骨骼肌細胞凋亡、干預細胞因子風暴、保護臟器功能等有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突