一測多評法同時測定阿娜爾婦潔液中7種成分

楊 莎，宋忠興，唐志書*，史鑫波，劉紅波，馬虎強，解亞娟，王昌利,

1.陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化省部共建協同創新中心/秦藥特色資源研究開發重點實驗室（培育）/陜西中藥產業研究院，陜西 咸陽 712083

2.陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽 712083

阿娜爾婦潔液由苦豆子、蛇床子、花椒、石榴皮、沒食子、冰片、珊瑚7 種藥材組成，具有清熱燥濕、止癢的功效，用于各種細菌性、霉菌性、滴蟲性外陰炎、陰道炎所致婦女陰部瘙癢、紅腫、白帶過多等癥狀。處方中蛇床子具有溫腎壯陽、殺蟲止癢、祛風燥濕等功效，可用于治療陰癢帶下、濕疹瘙癢、腎虛陽痿、濕痹腰痛、宮冷不孕等癥[1]。臨床上外用可用于治療各種皮膚病及滴蟲性陰道炎，手、足癬感染等疾病。蛇床子主要藥效成分為香豆素類成分，主要包括蛇床子素、花椒毒酚、花椒毒素、佛手柑內酯、歐前胡素、異茴芹內酯等成分[2-3]。現代藥理研究表明，蛇床子在抗菌、抗病毒、抗誘變、抗腫瘤、抗炎等方面療效顯著[4-8]。處方中花椒主要具有溫中止痛、殺蟲止癢功效，用于治療脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、蟲積腹痛；外治濕疹陰癢。研究表明，花椒的化學成分主要有揮發油、酰胺、生物堿、香豆素、木脂素、黃酮等[9]，而花椒中以花椒素為代表的鏈狀不飽和脂肪酸酰胺是花椒麻味的主要成分[10]。現代藥理研究表明，花椒具有鎮痛、抑菌、抗炎、抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、抗腹瀉、抑制平滑肌收縮等活性成分[11-12]。

中藥復方制劑組成復雜多樣，通過多成分、多靶點協同作用而達到治療作用，單一成分的檢測難以全面評價復方整體質量，故多指標成分質量控制模式已廣泛應用于中藥及其制劑的質量控制中。因此，建立多組分質量控制方法對提升本產品的質量控制水平具有重要意義。

有文獻報道了HPLC 法測定阿娜爾婦潔液中的蛇床子素和歐前胡素的含量[13]，苦參堿和槐定堿含量[14]，且均采用外標法對一種或幾種成分的含量進行測定，未見更多組分同時在阿娜爾婦潔液測定中的報道。一測多評（QAMS）法[15]利用中藥有效成分間存在的內在函數關系，建立內標與其他成分之間的相對校正因子（fs/i），僅使用一種質量穩定、易于獲得、價格低廉的對照品，實現對中藥及其制劑中多指標成分含量的同時測定，正成為質量評價新模式。近年來，該方法廣泛地應用于同類型化學成分以及一些紫外吸收相近的不同類型化學成分的定量分析，如木脂素類、黃酮類、蒽醌類、生物堿類以及皂苷類等[16-20]。綜上所述，花椒和蛇床子在本制劑中活性成分較為明確，鑒于目前，對于同時測定花椒和蛇床子中更多成分的定量鑒別還沒有相應的測定方法，筆者通過查閱大量的文獻，結合本品制備工藝方法，擬采用QAMS 法在其成品質量控制中選擇以花椒和蛇床子中的7 種成分作為定量測定指標。因此本實驗采用該方法，以花椒毒酚為內參物，建立了花椒毒酚與花椒毒素、異茴芹內酯、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、歐前胡素、蛇床子素之間的fs/i，利用fs/i計算阿娜爾婦潔液中7種成分的含量并與外標法所得的結果進行對比，驗證所建QAMS 法的可行性和準確性，為進一步提高該制劑質量控制和評價水平提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，Waters 2998檢測器，Empower 色譜工作站，Waters 公司；Agilent 1260 型高效液相色譜儀，包括自動進樣裝置，二元梯度泵，柱溫箱，DAD 檢測器，美國安捷倫科技公司；色譜柱為Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、YMC-Pack ODS-A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；CPA225D 電子天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；KQ-300DE 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q 型純水器，美國Millipore公司。

1.2 試藥

對照品花椒毒酚（批號P28M10M89335，質量分數98%）、花椒毒素（批號P30J7M16998，質量分數98%）、異茴芹內酯（批號R01J11F117174，質量分數98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；對照品羥基-α-山椒素（批號HR-2528W1，質量分數98%）、羥基-β-山椒素（批號HR-9532W1，質量分數98%）均購自寶雞晨光生物科技有限公司；對照品蛇床子素（批號110822-201710，質量分數99.5%）、歐前胡素（批號110826-201616，質量分數99.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院。蛇床子、花椒、苦豆子、冰片、珊瑚、石榴皮、沒食子均由陜西海天制藥有限公司提供，經陜西中醫藥大學劉世軍高級工程師鑒定均為正品，蛇床子為傘形科蛇床屬植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果實，花椒為蕓香科花椒屬植物花椒Zanthoxylum bungeanumMaxim.的干燥成熟果皮，苦豆子為豆科槐屬植物苦豆子Sophora alopecuroidesL.的干燥成熟種子，冰片為菊科植物艾納香Blumea balsamifera(L.)DC.的新鮮葉經提取加工制成的結晶，珊瑚為磯花科動物桃色珊瑚Corallium japonicumKishinouye 等珊瑚蟲分泌的石灰質骨骼，石榴皮為石榴科植物石榴Punica granatumL.的干燥果實，沒食子為殼斗科植物沒食子樹Quercus infectoriaOlivier 幼枝上由沒食子蜂Cynips gallae-tinctoriaeOlivier 寄生而成的蟲癭。阿娜爾婦潔液（150 mL/瓶，批號190603、190701、190702、190703、190704、190705、190706、191001、191002、191003）由陜西海天制藥有限公司提供。甲醇和乙腈均為色譜純，上海霍尼韋爾貿易有限公司；水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～8 min，2%～7%乙腈；8～13 min，7%～12%乙腈；13～39 min，12%～55%乙腈；39～42 min，55%～60%乙腈；42～55 min，60%～70%乙腈；55～60 min，70%～2%乙腈；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長218 nm（花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹內酯、歐前胡素[1,21-22]），267 nm（羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素[23]），320 nm（蛇床子素）；進樣量10 μL。該條件下，理論塔板數按花椒毒酚計算不低于1×105，各成分分離度良好（R＞1.5），色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)、阿娜爾婦潔液供試品(B)、缺花椒陰性樣品(C)和缺蛇床子陰性樣品(D)的HPLC 圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances(A),sample of A'naer Vigills(B),negative sample of Z.bungeanum(C),and negative sample of C.monnieri(D)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹內酯、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、歐前胡素和蛇床子素對照品適量，用甲醇制成質量濃度分別為300、410、820、530、280、340、500 μg/mL 的混合對照品溶液，搖勻，于4 ℃冰箱中避光保存，備用，濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取阿娜爾婦潔液10 mL，置分液漏斗中，加水20 mL，氨試液6 mL，混勻，用三氯甲烷提取5 次（20、20、15、15、15 mL），合并三氯甲烷層，加5 g 無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至50 mL 量瓶中，搖勻，濾過，取續濾液，過0.22 μm 微孔濾膜即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照處方比例以及制劑工藝，分別制備缺花椒、缺蛇床子的陰性樣品，按照“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密吸取適量“2.2.1”項下的混合對照品溶液1、2.5、5、7.5、10、15 μL，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，以進樣量作為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），進行線性回歸分析，得回歸方程花椒毒酚Y＝226 602X－68 179，r2＝1.000 0，線性范圍30～450 μg；花椒毒素Y＝311 951X－106 820，r2＝0.999 9，線性范圍41～615 μg；異茴芹內酯Y＝486 372X－144 726，r2＝0.999 9，線性范圍82～1230 μg；羥基-α-山椒素Y＝166 140X－56 687，r2＝0.999 8，線性范圍53～795 μg；羥基-β-山椒素Y＝66 487X－21 410，r2＝0.999 7，線性范圍28～420 μg；歐前胡素Y＝212 190X－66 499，r2＝0.999 6，線性范圍34～510 μg；蛇床子素Y＝290 272X－92 455，r2＝0.999 7，線性范圍50～750 μg。結果表明，7 種成分在各自相應范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 取“2.2.1”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6 次，記錄各組分峰面積，結果花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹內酯、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、歐前胡素、蛇床子素的峰面積RSD值分別為0.49%、0.64%、0.67%、0.66%、0.57%、0.70%、0.61%，表明在該條件下儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一批阿娜爾婦潔液樣品（批號191001），按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，得花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹內酯、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、歐前胡素、蛇床子素的峰面積RSD 值分別為2.20%、1.49%、1.48%、1.32%、1.29%、1.43%、1.43%，表明該供試品溶液在室溫下24 h內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批阿娜爾婦潔液樣品（批號191001），按照“2.2.2”項下操作條件平行制備6 份供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行測定，計算花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹內酯、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、歐前胡素、蛇床子素的含量及其RSD，結果測得7 個成分平均質量濃度分別為0.464 4、0.351 1、0.747 1、1.318 2、0.565 5、0.965 4、2.883 1 mg/mL，RSD 值分別為2.05%、2.74%、1.91%、1.68%、1.48%、1.60%、1.66%，說明該方法的重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取同一批阿娜爾婦潔液樣品（批號191001）共9 份，每份10 mL，分成3組，置100 mL 具塞錐形瓶中，分別按已知質量濃度的50%、100%、150% 3 個水平加入各對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜峰，計算加樣回收率。結果花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹內酯、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、歐前胡素、蛇床子素的平均加樣回收率分別為102.51%、99.75%、98.80%、103.70%、100.82%、98.67%、101.06%，RSD 分別為1.53%、1.30%、1.75%、2.69%、1.16%、1.74%、1.78%，表明該方法準確度良好。

2.4 fs/i 的確定及其耐用性考察

2.4.1fs/i的測定 取“2.2.1”項下的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣1、3、5、7、9、11 μL，記錄各成分峰面積，以花椒毒酚為內參物，采用多點校正法，按照下面公式分別計算花椒毒素、異茴芹內酯、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、歐前胡素、蛇床子素的fs/i，結果見表1。

表1 各組分的fs/iTable 1 fs/i values of each component

fs/i＝fs/fi＝AsCi/AiCs

As為花椒毒酚對照品的峰面積，Cs為花椒毒酚對照品的質量濃度，Ai為待測成分峰面積，Ci為待測成分的質量濃度

2.4.2 不同儀器對fs/i的影響 考察了2臺儀器對fs/i的影響，結果見表2。表明不同儀器對所測組分的fs/i無明顯影響。

表2 不同儀器對fs/i 的影響Table 2 Effects of different instruments on fs/i

2.4.3 不同色譜柱對fs/i的影響 考察了Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、YMC-Pack ODS-A（250 mm×4.6 mm，5 μm）對7 個組分fs/i的影響，結果見表3。表明3 根色譜柱對各成分的fs/i無明顯影響。

表3 不同色譜柱對fs/i 的影響Table 3 Effects of different columns on fs/i

2.4.4 不同柱溫對fs/i的影響 考察了柱溫25、28、30、32、35 ℃對fs/i的影響，結果見表4。表明不同柱溫對各成分的fs/i無明顯影響。

表4 不同柱溫對fs/i 的影響Table 4 Effects of different column temperatures on fs/i

2.4.5 體積流量對fs/i的影響 本實驗考察了不同體積流量0.8、0.9、1.0 mL/min 對fs/i的影響，結果見表5。表明不同體積流量的變化對各成分的fs/i無明顯影響。

表5 不同體積流量對fs/i 的影響Table 5 Effects of different volumetric flow rates on fs/i

綜上幾種因素，說明該方法對fs/i耐用性良好。

2.5 待測組分色譜峰定位

取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以花椒毒酚為內標，并考察其他6 種成分在不同儀器、色譜柱的相對保留時間（ts/i），對待測成分色譜峰進行定位，結果見表6。

表6 不同色譜柱測得的相對保留值Table 6 Relative retention value of different columns

2.6 QAMS 法與外標法結果對比

取10 批樣品，按照“2.2.2”項下條件制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，采用QAMS 法建立內參物花椒毒酚與花椒毒素、異茴芹內酯、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、歐前胡素、蛇床子素的fs/i，對10 批阿娜爾婦潔液樣品中7種成分進行含量測定，同時采用外標法對花椒毒素、異茴芹內酯、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、歐前胡素、蛇床子素成分進行含量測定，結果見表7。結果發現，外標法與QAMS 法測定的組分含量基本一致，經t檢驗比較顯示，外標法實測各成分含量值與QAMS 法所測成分含量值無顯著性差異，10 批樣品中花椒毒酚與花椒毒素、異茴芹內酯、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、歐前胡素、蛇床子素外標法與QAMS 法綜合質量濃度分別為0.450 3～0.523 3、0.355 2～0.395 8、0.744 7～0.819 3、1.275 9～1.356 0、0.546 6～0.592 4、0.941 3～1.053 1、2.796 6～3.152 9 mg/mL，以蛇床子素、羥基-α-山椒素、歐前胡素等成分含量較高。

表7 QAMS 法與外標法測定10 批阿娜爾婦潔液中7種成分的質量濃度Table 7 Content of seven constituents in ten batches of A'naer Vigills by QAMS and ESM

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的篩選

本實驗考察了供試品溶液制備方法，即取樣品適量用甲醇直接稀釋濾過制得樣品；取本品適量置分液漏斗中，加乙醚提取4 次（30、30、20、20 mL），提取液蒸干，殘渣加適量甲醇使溶解濾過制得樣品[24]；量取本品適量，水浴蒸干，殘渣加適量甲醇溶解，超聲處理，濾過制得樣品[25]；取本品適量，置分液漏斗中，加水20 mL，氨試液6 mL，混勻，用三氯甲烷提取5 次（20、20、15、15、15 mL），合并三氯甲烷層，加5 g 無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至50 mL 量瓶中，搖勻，濾過制得樣品。結果發現第4 種方法制得的樣品檢測出的譜圖相對較多，各峰高比例適中，分離度較好，基線平穩，因此以第4 種方法作為阿娜爾婦潔液供試品的制樣方法。

3.2 流動相的篩選

本實驗考察了甲醇、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同體系流動相，結果表明乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相色譜峰峰形較好，各峰之間的分離度良好，基線較平穩，最終選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相。

3.3 檢測波長的選擇

通過紫外掃描光譜可知花椒毒酚、花椒毒素、異茴芹內酯、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、歐前胡素、蛇床子素的最大吸收波長分別為218.5、217.4、223.3、270.6、267.0、218.5、321.7 nm，通過比較分析在波長218 nm 條件下的峰數目、峰形、分離度、對稱因子、理論塔板數等參數發現，在波長218 nm 條件下，上述信息均相對較好，故選擇以218 nm 作為含量分析波長。

4 結論

本研究首次建立了QAMS 法同時測定阿娜爾婦潔液中7種成分的含量，通過考察不同液相色譜儀、不同品牌色譜柱、柱溫以及體積流量對fs/i的影響，對QAMS 法的可行性進行了探討，結果表明，在本實驗條件下外標法和QAMS 法均無顯著差異。同時采用QAMS 法和外標法分別測定10 批阿娜爾婦潔液中7種成分的含量，結果表明QAMS 法和外標法測得的結果沒有顯著差異，說明在對照品短缺的情況下，以花椒毒酚為內參物建立的QAMS 法可用于阿娜爾婦潔液指標性成分含量測定和質量評價，為全面評價該制劑質量提供參考依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突