淡豆豉炮制過程中拮抗菌對黃曲霉毒素B1的拮抗能力考察

李春玲，賀 婧，王立元，趙綿江，李翠英，翁美芝，周立分*，周 鴻，謝小梅*

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004

2.南昌大學轉化醫學研究院，江西 南昌 330031

3.江西省疾病預防控制中心，江西 南昌 330029

淡豆豉Sojae Semen Praeparatum別名香豉（《傷寒論》），為大豆Glycine max(L.)Merr.的成熟種子（黑大豆）與桑葉、青蒿經發酵加工而成。其性味苦、辛、涼，歸肺、胃經，具有解表、除煩、宣發郁熱之功效，用于感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠等，被歷代本草和歷版《中國藥典》收錄，列入衛生部首批藥食兩用名單，在心血管疾病、糖尿病、骨質疏松、乳腺癌及女性更年期綜合征、抑郁癥等重大疾病的預防和控制中有廣闊應用前景[1-2]。

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）主要由黃曲霉菌Aspergillus flavus和寄生曲霉菌A.parasiticus產生的一類化學結構類似的次級代謝產物，在中藥材、豆類、花生、玉米以及奶制品、植物油等產品中廣泛存在[3]。AFT 致癌、致畸和致突變性極強，是至今發現的最強致癌真菌毒素化合物。它們降低體內胰腺消化酶活性，影響免疫力，損傷動物肝臟、中樞神經功能等，引起一系列疾病，如貧血、腸胃疾病、生長性能障礙、生殖障礙等[4-7]。其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）毒性最強，已被國際癌癥機構定義為I類致癌物[8-9]。食入被AFT（尤其是AFB1）污染的中藥材，不僅達不到防病治病的效果，反而會使AFT 在人體內積累中毒，危及健康甚至生命，給中藥的臨床應用帶來嚴重安全隱患。

淡豆豉在炮制過程中受原料、加工器具、溫度、濕度等外界環境的影響，極易污染AFT，然而迄今關于淡豆豉炮制中AFT 的研究極少。本實驗室前期已發現淡豆豉炮制過程中存在黃曲霉、溜曲霉等可能產AFT 的產毒菌[10]，同時也分離到如枯草芽孢桿菌、乳酸菌、黑曲霉菌等已報道能抑制AFT 產生的有益菌（簡稱拮抗菌）[11-13]，并發現淡豆豉炮制過程中不同時間點樣本的AFT 含量、產毒菌的數量和產毒能力存在動態變化。

基于此，本實驗應用LC-MS 技術檢測AFB1，研究從淡豆豉炮制過程中分離的枯草芽孢桿菌、鮭色鎖擲酵母菌、黑曲霉菌、屎腸球菌、鳥腸球菌及其代謝產物對產毒黃曲霉菌生長的影響，以及它們對AFB1的降解能力，為探討淡豆豉炮制過程中AFT 消長機制奠定基礎，并將篩選到的AFB1拮抗菌應用于淡豆豉炮制中，對降低淡豆豉成品的AFB1污染有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 產毒黃曲霉菌（CGMCC3.4408）購于中國普通微生物菌種保藏中心。鮭色鎖擲酵母菌Saccharomyces salmonicolor（EJ1）、屎腸球菌Enterococcus faecium（BR5）、鳥腸球菌Enterococcus avium（9R2）、黑曲霉Aspergillus niger（JC2）和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis（JX2）均為本實驗室從淡豆豉炮制過程中篩選鑒定并保存，由江西中醫藥大學謝小梅教授和王立元副教授鑒定。

1.1.2 培養基 PDA 培養基、曲霉素瓊脂培養基、腦心浸液肉湯培養基，批號20191113、20191026、20201017，青島高科技海博生物技術有限公司。

細菌種子培養基：葡萄糖50 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，KH2PO41 g，Fe2SO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.0。

細菌發酵培養基：葡萄糖23.5 g，蛋白胨10 g，乙酸銨8.5 g，KH2PO44.1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，加水1000 mL，pH 6.0。

真菌發酵培養基：葡萄糖30 g，NaNO33 g，酵母提取物1 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，L-谷氨酸鈉10 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.0。以上培養基均在121 ℃下濕熱滅菌20 min。

1.1.3 試劑 AFB1對照品，批號A832707-1mg，質量分數≥98%，麥克林有限公司；甲醇、乙腈，批號2003191、20022221，體積分數≥99.9%，羅恩公司；甲酸，批號C11265520，體積分數≥99.9%，阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 儀器

MJ-150I霉菌培養箱、DHP-9082 細菌培養箱，上海一恒科技有限公司；AB Triple Quad 4500 超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀，美國AB Sciex公司；Milli-Q Advantage A10 超純水儀，美國Millipore 公司。

2 方法與結果

2.1 LC-MS 檢測降解AFB1 研究

2.1.1 色譜條件 Hypersil Gold（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱溫25 ℃；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～1 min，35%乙腈；1～2.5 min，35%～50%乙腈；2.5～3 min，50%～80%乙腈；3～3.1 min，80%～35%乙腈；3.1～5 min，35%乙腈；體積流量0.2 mL/min；進樣量2 μL。

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正離子模式；離子噴射電壓（ion spray voltage，IS）4.5 kV；離子源溫度（ion source temperature，TEM）500 ℃；霧化氣（nebulizer gas,GS1）壓力310.264 kPa（45 psi），加熱氣（heater gas，GS2）壓力344.738 kPa（50 psi），氣簾氣體（curtain gas，N2），壓力241.316 kPa（35 psi）。掃描方式為多重反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）。碰撞電壓150 V，去簇電壓32 V，母離子m/z313.0，子離子m/z285.4、254.0；保留時間5 min。

2.1.3 對照品溶液的制備 準確稱取0.1 mg AFB1對照品于50 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 濾膜，即得2 μg/mL 的AFB1對照品儲備液。

2.1.4 供試品溶液的制備 將斜面保存的5 株待測菌分別接種于相應培養基上活化（細菌、真菌分別接于腦心浸液肉湯、PDA 液體培養基），挑取一環接種于25 mL 種子培養液中，細菌經37 ℃培養12 h 后，吸取1 mL 種子液接種于25 mL 細菌發酵培養液中，37 ℃培養2 d。真菌接種于25 mL 真菌發酵培養液中，28 ℃培養3 d。避光條件下，吸取980 μL 各發酵菌液加20 μL 100 μg/mL 的AFB1對照品，使各發酵菌液中AFB1終質量濃度為2 μg/mL，以只加20 μL 100 μg/mL的AFB1對照品不接種菌的發酵培養液作對照，37 ℃避光孵育72 h。

分別取上述孵育72 h 的各發酵液1 mL，用氮氣吹至近干，加1 mL 甲醇復溶，11 269.44×g離心10 min，上清液經0.22 μm 濾膜濾過后用LC-MS檢測。

2.1.5 線性關系考察 精確吸取0.005、0.010、0.025、0.040、0.050、0.075、0.100 mL 的AFB1對照品儲存液于1 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，使之成10、20、50、80、100、150、200 ng/mL 的系列對照品溶液，混勻，上機測定。AFB1標準曲線為Y＝23 904X＋135 965，r2＝0.999 3，質量濃度在10～200 ng/mL 呈良好線性關系。

2.1.6 精密度考察 配制AFB1質量濃度為100 ng/mL 的對照品溶液，連續重復進樣6 次，按峰面積計算，RSD 為0.62%

2.1.7 穩定性考察 取無菌發酵液，精密加AFB1對照品溶液，使之最終質量濃度為100 ng/mL。按“2.1.4”項供試品溶液的制備步驟操作，分別測定0、4、8、12、16、20、24 h 時的AFB1含量，以峰面積來計算，RSD 為1.01%。

2.1.8 重復性考察 平行取無菌發酵液6 份，精密加 AFB1對照品溶液，使之終質量濃度為 100 ng/mL。按“2.1.4”項供試品溶液制備步驟操作，按“2.1.1”項色譜條件，分別進樣2 μL 進行測定，以AFB1含量來計算，RSD 為1.50%。

2.1.9 加樣回收率考察 平行取無菌發酵液9 份，分別精密加入低、中、高質量濃度的對照品溶液，每個濃度3 份，使發酵液中AFB1終濃度分別為50、100、200 ng/mL，按“2.1.4”項供試品溶液制備步驟操作，制備供試品溶液，進樣分析，檢測含量。用甲醇制備相應質量濃度的對照品溶液，進樣分析，檢測含量。計算加樣回收率。以發酵液為基質，測得低、中、高3 個質量濃度水平時AFB1的平均回收率分別為92.40%、94.32%、97.20%，RSD 分別為2.35%、1.48%、1.85%（n＝3）。

2.2 5 株待測菌對AFB1 的降解作用

具體操作方法見“2.1.4”項。結果顯示，5 株菌發酵菌液均對AFB1有一定的降解作用，其中鮭色鎖擲酵母菌對AFB1的降解作用最強，達43.65%，黑曲霉菌的降解作用最弱。各菌株發酵液中AFB1的液質聯用色譜圖如圖1所示，降解率見表1。

表1 5 株菌的種子培養液和發酵上清液對黃曲霉生長的抑制效果及對AFB1 的降解作用(,n=3)Table 1 Growth inhibition of A.flavus and degradation of AFB1 by five strains(,n=3)

表1 5 株菌的種子培養液和發酵上清液對黃曲霉生長的抑制效果及對AFB1 的降解作用(,n=3)Table 1 Growth inhibition of A.flavus and degradation of AFB1 by five strains(,n=3)

菌株 AFB1 降解率/% 種子培養液抑菌率/% 發酵上清液抑菌率/%鳥腸球菌 17.53±0.39 32.14±1.79 16.67±1.04屎腸球菌 34.02±0.87 32.14±1.79 29.63±1.56枯草芽孢桿菌 27.49±0.66 33.93±2.28 24.07±1.04鮭色鎖擲酵母菌 43.65±0.98 64.29±3.57 24.07±1.88黑曲霉菌 7.22±0.20 32.14±1.55 25.93±0.52黃曲霉菌標準株 3.21±0.11--

圖1 液質聯用色譜圖Fig.1 LC-MS chromatograms

AFB1降解率＝(對照組AFB1含量－試驗組AFB1含量)/對照組AFB1含量

2.3 5 株待測菌對產毒黃曲霉生長的影響

2.3.1 產毒黃曲霉標準株（CGMCC3.4408）的孢子懸浮液制備 將產毒黃曲霉菌標準株接種于PDA培養基上，28 ℃培養5 d，加入適量無菌生理鹽水洗脫黃曲霉孢子，無菌紗布濾過以濾除菌絲，血球計數板將黃曲霉孢子懸浮液調整為1×105cfu/mL，備用。

2.3.2 待測菌的培養

（1）待測菌種子液的制備：挑取經活化培養的待測菌，接種于20 mL 種子培養液中，細菌37 ℃靜置培養12 h，真菌28 ℃、120 r/min 培養72 h。將上述種子液梯度稀釋，選擇合適的3 個稀釋梯度，用移液槍吸取100 μL 稀釋液分別注入相應的選擇性培養基平板涂布均勻。細菌置37 ℃培養1 d，真菌置28 ℃培養3～5 d，分別對細菌、真菌進行計數，調整至1×107cfu/mL 的稀釋液作為種子液，備用。

（2）待測菌發酵液的制備：吸取1 mL 1×107cfu/mL 的種子液接種于25 mL 細菌/真菌相應發酵培養基中，細菌于37 ℃培養72 h，真菌于28 ℃、120 r/min 培養96 h。

2.3.3 5 株待測菌對產毒黃曲霉生長的影響

（1）平板對峙法檢測待測菌對產毒黃曲霉生長的影響：將1×105cfu/mL 的標準株黃曲霉孢子液10 μL 接種于培養基中央，用十字交叉法接種20 μL 1×107cfu/mL 各待測菌種子液于等距的4 端。以僅接種105cfu/mL 的黃曲霉標準株孢子于培養基中央作為對照組，分別置28 ℃霉菌培養箱培養5 d，量取并記錄黃曲霉標準株菌落直徑，計算抑菌率，每組3 個平行。

抑菌率＝(對照組黃曲霉菌落直徑－實驗組黃曲霉菌落直徑)/對照組黃曲霉菌落直徑

各組黃曲霉菌生長狀況如圖2所示。結果（表1）顯示，5 株菌種子培養液對產毒黃曲霉生長均有一定的抑制作用，其中鮭色鎖擲酵母菌對黃曲霉生長的抑制作用最強，抑菌率達64.29%，屎腸球菌、鳥腸球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉對黃曲霉生長的抑制率均在30%左右。

圖2 平板對峙培養法檢測各菌對產毒黃曲霉菌生長的影響Fig.2 Growth of A.flavus detected by plate confrontation culture

（2）待測菌發酵上清液對產毒黃曲霉菌生長的影響：取各待測菌株發酵液10 mL，11 269.44×g離心5 min，取上清液，0.22 μm 無菌濾膜濾過除菌。吸取8 mL 濾過除菌的上清液加入90 mm 的培養皿中，傾注20 mL PDA 培養基與之混勻，在平皿中央接種20 μL 1×105cfu/mL 的黃曲霉標準株孢子液，以平皿中央僅接種1×105cfu/mL 黃曲霉標準株孢子液作對照。分別置28 ℃霉菌培養箱培養5 d，記錄菌落直徑，計算抑菌率，每組3 個平行。

抑菌率＝(對照組黃曲霉菌落直徑－實驗組黃曲霉菌落直徑)/對照組黃曲霉菌落直徑

各組黃曲霉菌的生長狀況如圖3所示。結果（表1）顯示，5 株待測菌發酵上清液對產毒黃曲霉生長均有一定的抑制作用，其中屎腸球菌的抑制作用最強，抑制率為29.63%。

圖3 各菌株發酵上清液對產毒黃曲霉生長的影響Fig.3 Effect of fermentation supernatant of different strains on growth of A.flavus

綜上，5 株菌的發酵上清液對產毒黃曲霉菌的生長均有一定的抑制作用，表明5 株菌均可產生抑制產毒黃曲霉生長的代謝物質，如蛋白酶、有機酸等；5 株菌的種子培養液抑菌率均強于發酵上清液的抑菌率，表明這5 株菌通過空間性、營養性競爭來抑制產毒黃曲霉生長的效果強于其代謝產物的抑制效果；鮭色鎖擲酵母菌的種子培養液抑菌率和AFB1降解率均強于其他4 株菌，而其發酵上清液抑制率與其他4 株菌差別不大，表明在淡豆豉炮制過程中，鮭色鎖擲酵母菌在抑制產毒黃曲霉生長繁殖和降解AFB1方面發揮了較大的作用。

3 討論

空氣、水、土壤等自然環境中可能存在大量產AFT 的微生物，因此中藥材很容易受到產AFT 菌的污染而產生AFT。解決中藥材安全問題必須嚴格控制中藥材AFT 污染。本實驗建立了LC-MS 測定發酵液中AFB1的方法。該方法具有快速、準確、靈敏等特點，有助于提高分析效率，降低成本，為測定發酵液中AFB1含量提供參考。

目前，中藥材中黃曲霉毒素污染的防治措施主要分為2 種：預防和降解。預防措施主要在生產過程中減少產AFT 菌的污染和儲藏條件控制等。降解方法主要有3 種：物理、化學和生物方法。物理方法如輻射法等，降解效果較好，但可能存在使被輻射的產品過氧化值增加，因穿透力差而未能徹底去除，甚至觸發存活的產毒菌株產生黃曲霉毒素B1等問題[14-15]，化學方法如堿處理法降解作用比較強，但成本高，污染大[16]。而使用生物脫毒法更天然、綠色、安全和經濟[17]。

近年來，國內外已對降解AFB1和抑制產AFT菌生長的微生物進行了大量研究。研究發現，一些微生物，如乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌，可抑制曲霉菌的生長及其產毒，在控制AFT 污染方面有著巨大的應用價值。Osouli 等[18]研究了枯草芽孢桿菌M419 無細胞上清液對黃曲霉的抑制率為57%。張秀江等[19]研究發現，質量濃度為0.25 mg/mL 的酵母霉菌毒素降解劑對AFB1的脫毒效率最好，為98.21%。吉小鳳等[20]研究發現從肉雞腸道糞便中篩選到的發酵乳桿菌LAB-10 對14 μg/L AFB1在48 h的降解率為63.4%。

本研究表明從淡豆豉炮制過程中分離的5 株菌對產AFT 的黃曲霉生長繁殖均有一定的抑制作用，同時對AFB1的降解也有一定的效果。屎腸球菌、鳥腸球菌和枯草芽胞桿菌對產毒黃曲霉菌的抑制率均達30%以上，這3 種菌同時是淡豆豉炮制過程中的優勢菌，在抑制產毒黃曲霉菌生長繁殖的同時，還可以促進 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的產生[21]。5 株菌中鮭色鎖擲酵母菌對產毒菌生長的抑制作用和降解AFB1的效果最好，抑制率和降解率分別為64.29%、43.65%。

本課題組前期研究發現鮭色鎖擲酵母菌在整個淡豆豉炮制過程中始終存在，并且呈先上升后下降的趨勢，在再悶第3 天達到最大值。文獻報道鮭色鎖擲酵母菌由于可產生多種具有芳香氣味的酯類化合物，其在培養過程中會發出類似于天然水果發出的香味[22-23]。因此淡豆豉炮制過程中鮭色鎖擲酵母菌的存在，使炮制出來的淡豆豉具有黃曲霉毒素含量少甚至無毒并且香味濃郁以及GABA 產量高等特點。

微生物降解AFT 的主要機制是通過吸附作用或酶促反應降解毒素或者修飾毒素分子而達到脫毒的目的。吸附作用主要是通過微生物與產毒菌結合成較穩定的無毒復合物而排出體外，而酶促作用是通過微生物分泌的酶破壞AFT 的毒性結構位點雙呋喃環末端雙鍵、內酯環和環戊烯酮環，產生無毒的降解產物[24-27]。嚴家俊[28]對一株枯草芽胞桿菌降解AFB1作用機制的研究發現，菌株培養液中上清液對AFB1的降解率達到82.6%，對培養液上清液進行熱處理及蛋白酶K 處理后，發現處理后的上清液對AFB1的降解能力大大降低，推測出現這種情況是菌株降解AFB1的活性物質經熱處理和蛋白酶K 處理后，酶活性被降低，說明該菌株對AFB1的降解過程為菌株胞外酶的酶促反應。

一些食用豆醬類食品中含有AFT 拮抗微生物，這些微生物可以通過吸附、降解等作用使食品中的AFT 減少。Huang 等[29]研究發現發酵食品豆腐中存在一種益生菌-植物乳桿菌，它可以與AFB1結合成一種穩定的復合物而排出體外，從而減輕AFB1對小鼠的毒性。張盼等[30]從食用納豆中篩選出一株高效降解AFB1的枯草芽孢桿菌，該細菌的發酵上清液經濃縮后制成的粗酶液對AFB1降解率達91.4%。在淡豆豉炮制中，AFT 產毒菌和拮抗菌可能通過競爭生長空間和營養物質、分泌有機酸、過氧化物、蛋白酶等代謝產物抑制產AFT 菌的孢子萌發和菌絲生長。

目前，有許多研究者對拮抗菌抑制產毒菌株生長繁殖機制進行了大量的研究。微生物對產AFT 菌生長的抑制作用主要分為競爭抑制作用和代謝產物抑制作用。競爭抑制作用機制主要是產毒菌被非產毒菌株競爭生長空間而被物理排除，或與產毒菌競爭生長和合成毒素的營養物質。代謝產物抑制作用是通過拮抗菌產生的一些酶、有機酸和抗生素等物質來抑制產毒菌的生長和產毒，如芽孢桿菌產生的抗生素和蛋白酶，乳酸菌產生的有機酸和多肽，酵母菌產生的幾丁質酶等均對黃曲霉的生長有很強的抑制作用[31]。

本研究中，5 株菌的種子液對產毒黃曲霉菌均有一定的抑制作用，這種抑制作用可能是競爭性抑制或是代謝產物抑制。5 株菌的過濾無菌發酵液對產毒黃曲霉菌均有一定的抑制作用，但其抑制效果弱于種子液，由此說明5 株菌對產毒黃曲霉菌生長的抑制作用是通過營養競爭性抑制和代謝產物抑制的共同結果。

淡豆豉炮制過程中多種微生物共同參與，不同炮制時間點存在不同的優勢菌，整個炮制過程中微生物種類呈交替更迭，炮制至后期已不存在黃曲霉和溜曲霉等可能產生AFT 的微生物[9-12]。本實驗室前期檢測了淡豆豉炮制過程中各時間點AFT 的含量，發現“黃衣上遍”階段中的發酵第3 天、發酵第6 天，以及“再悶”階段中的再悶第3 天、再悶第6 天、再悶第9 天均存在AFT 污染，再悶第6天達到最大值，再悶第9 天下降到1.2 ng/mL，同時也發現發酵第3 天、發酵第6 天、再悶第3 天、再悶第6 天均存在產AFT 菌株，主要為黃曲霉菌和溜曲霉菌，發酵第6 天產毒菌數量最多，再悶第3 天檢測到菌落數開始下降。本研究表明多種拮抗菌導致了淡豆豉炮制中產AFT 菌數量和AFB1含量的動態變化，研究結果將為揭示淡豆豉炮制過程AFT 消長機制奠定基礎，并為淡豆豉黃曲霉毒素的防控措施提供科學依據。

本實驗室后續將進一步篩選鑒定既能抑制產毒菌產AFB1又能降解AFB1的高效拮抗菌，并對拮抗菌的拮抗機制和安全性等深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突