基于UHPLC-Q-Orbitrap和網絡藥理學的燈盞生脈膠囊治療心絞痛的機制研究

李卓倫，楊彥濤，孫 志，師瑩瑩，高一喬，賈雪冬，康 建，周 霖，賈清泉，張曉堅*

1.鄭州大學第一附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450052

2.河南省精準臨床藥學重點實驗室，河南 鄭州 450052

燈盞生脈膠囊由燈盞細辛、麥冬、人參和五味子4 味藥材提取加工制成[1]，具有益氣養陰、活血健腦的功效，臨床上常用于治療中風后遺癥、高脂血癥、冠心病心絞痛、缺血性心腦血管疾病等病癥[2-4]。但燈盞生脈膠囊藥效物質的相關研究匱乏，嚴重限制了對其在臨床上精準用藥的指導。因此亟需建立一種高通量、高分辨率、高靈敏度且能科學預測其在人體內作用靶點的方法對燈盞生脈膠囊藥效物質基礎進行分析。

超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）因其優異的分辨能力、良好的質量準確度和靈敏度，可在一個分析周期內獲得大量高精度的一級、二級質譜信息，現已逐步成為中藥藥效成分快速準確鑒定的重要手段。網絡藥理學具有整體性、系統性的特點，其融合系統生物學、多向藥理學、計算生物學、網絡分析等多學科的技術和內容，進行“疾病-表型-基因-藥物”多層次網絡的構建，從整體的角度探索藥物與疾病間的關聯，發現藥物靶標，指導合理用藥[5-6]。

本實驗利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術結合網絡藥理學對燈盞生脈膠囊中化合物成分構成及其相關靶點、疾病進行了鑒定分析。通過利用高分辨質譜獲得的精確相對分子質量、保留時間及碎片離子信息，共獲得黃酮類、木脂素類、酚酸類、皂苷類和其他類共5 類30 種化合物，并結合網絡藥理學分析心絞痛相關的靶點，構建燈盞生脈膠囊“化合物-靶點-疾病”網絡，最終獲得對治療心絞痛起藥效作用的化合物。本實驗為進一步明確燈盞生脈膠囊藥效物質基礎和指導臨床合理用藥奠定了堅實的理論基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UHPLC-Q-Orbitrap 液相色譜-質譜聯用系統：Ultimate 3000 超高效液相色譜（Dionex 公司，美國）串聯 Q-Exactive 型高分辨質譜（Thermo FisherScientific 公司，美國）；WatersACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters 公司，美國）；Master-E 型超純水機（上海和泰儀器有限公司）；New Classic MS 型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo 上海有限公司）；MDS-6G 型多通量微波消解/萃取系統（上海新儀微波化學科技有限公司）。

1.2 試劑

燈盞生脈膠囊（云南生物谷藥業股份有限公司，批號Z20026439）；對照品琥珀酸（批號MUST-17030502）、原兒茶酸（批號MUST-16032112）、綠原酸（批號MUST-16031610）、原兒茶醛（批號MUST-15091608）、咖啡酸（批號MUST-15090803）、阿魏酸（批號MUST-15091605）、木犀草素（批號MUST-16011015）、芹菜素（批號MUST-16061301）、山柰酚（批號MUST-16032801）、戈米辛D（批號MUST-17120902）、戈 米 辛 J（批 號MUST-17102802）、人參皂苷Rg3（批號MUST-17030711）、五味子酚（批號MUST-17040209）、五味子甲素（批號MUST-17022401）、五味子乙素（批號 MUST-17031606）、五味子丙素（批號MUST-17031816）均購于成都曼思特生物科技有限公司；以上對照品經峰面積歸一化質量分數大于99%。甲酸、甲醇及乙腈為色譜純級，美國Fisher 公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜及質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為 Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫：0～1 min，5% A；1～5 min，5%～35% A；5～15 min，35%～40% A；15～25 min，40%～50% A；25～32 min，50%～65% A；32～42 min，65%～100%A；42～47 min，100% A；47～47.1 min，100%～5% A；47.1～50 min，5% A；體積流量為0.2 mL/min；進樣量5 μL；柱溫40 ℃。

2.1.2 質譜條件 UHPLC-Q Exactive 液質聯用儀離子源采用HESI 源（heated ESI），輔助氣體積流量為10 arb，輔助氣溫度為300 ℃，離子傳輸管溫度320 ℃；正離子模式下：鞘氣體積流量為40 arb，噴霧電壓為3.50 kV；負離子模式下：鞘氣體積流量為38 arb，噴霧電壓為2.80 kV。掃描方式為正、負離子Full MS/dd-MS2 模式，其中包括1 次一級全掃描（分辨率為70 000 FWHM）和1 次數據依賴的二級掃描（分辨率為17 500 FWHM）2 個事件，質荷比窗口寬度設置為2，碰撞能梯度為20、50、100 eV，掃描范圍m/z80～1200。

2.2 供試品溶液的制備

取燈盞生脈膠囊3 粒，去殼后，取內容物約1.0 g，精密稱定后，置于具塞錐形瓶中，精密量取并加入純甲醇50 mL，密塞并稱定質量，微波萃?。üβ?00 W）17 min，搖勻后經0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得樣品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

取各對照品約1.0 mg，精密稱定后，分別置于10 mL 量瓶中，加入純甲醉溶解并稀釋至刻度，搖勻，最終制備成質量濃度為0.1 mg/mL 的單一對照品儲備液；分別精密量取上述單一對照品儲備液適量，將其混合后加入甲醇稀釋，最終制備成各對照品質量濃度均為1 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.4 化合物結構分析

依照“2.1”項下優化后的色譜質譜條件進樣后，根據高分辨質譜提供的準分子離子和加荷離子等信息推測并得到各成分的精確相對分子質量，經Xcalibar 3.0 軟件擬合分子式，并與數據庫進行比對，以對各色譜峰進行初步推測，再依據對照品、Mass Frontier 軟件或參考文獻、Mass Bank、Chemical Book等數據庫提供的保留時間及高能碰撞下產生的多級碎片離子信息，進一步準確識別化學成分。

2.5 網絡藥理學分析

2.5.1 燈盞生脈膠囊成分-靶點預測 本研究以藥物成分含量高低、是否為入血成分和文獻報道有重要藥理作用為依據進行生物活性成分篩選，通過ChemBioDraw Ultra 12.0 繪制各成分的結構并得到各化合物的Smile 號、InChIkey 號等相關信息，利用TCMSP 數據庫、STITCH 數據庫查找各成分對應的相關靶點，并剔除無相關靶點的成分。由于不同數據庫對靶點命名存在不規范性，故借助Uniprot數據庫將所有靶點名稱統一為官方基因名（official gene symbol）。最后借助Cytoscape 3.6.1 軟件構建“燈盞生脈膠囊”活性成分-靶點相互作用網絡，以節點（node）表示成分和作用靶點，以邊（edge）表示成分與靶點間的相互作用[7-9]。

2.5.2 心絞痛相關靶點的收集 以“angina”為檢索詞，通過OMIM 數據庫、TDD 數據庫、GAD 數據庫、GeneCards 數據庫、DigSee 數據庫和DisGenet數據庫對心絞痛相關靶點進行檢索，刪除重復得到心絞痛相關的疾病靶點[7-9]。

2.5.3 基于藥物和疾病靶點交集網絡的關鍵靶點篩選

（1）蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網絡的構建：通過借助Cytoscape 3.6.1 軟件中BisoGenet 3.0.0 插件所包含的 Database of Interacting Proteins（DIP）、Biological General Respository for Interaction Datasets（BIOGRID）、Human Protein Reference Database（HPRD）、IntAct Molecular Interaction Database（INTACT）、Molecular Interaction Database（MINT）、Biomolecular Interaction Network Database（BIND）等6 種蛋白相互作用關系數據庫，燈盞生脈膠囊“活性成分-靶點”的PPI 網絡和“疾病-靶點”的PPI 網絡得以構建。相關參數設置為：Organism：Homo sapiens（Human）；Map input identifiers list to：Gene identifiers only；Data settings:Protein Protein Interaction，勾選DIP/BIOGRID/HRPD/INTACT/MINT/BIN[7-9]。

（2）關鍵靶點篩選：利用Cytoscape 軟件中的Merge 功能將兩個PPI 網絡進行整合提取其交集網絡，并采用NetworkAnalyzer 功能對網絡做拓撲結構分析，得到的網絡連接度（Degree）值越高，表明該節點在網絡中越重要；選擇Degree 大于其中位數值兩倍以上的節點作為關鍵候選靶點，然后基于CytoNCA插件計算網絡節點的6個拓撲特征值度中心性（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closenesscentrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、網絡中心性（network centrality，NC）和局部邊連通性（localaverage connectivity，LAC）提取分析這些候選節點網絡關系，這6 個拓撲結構特征值越大，在網絡中越重要，選擇以上6 個特征值均大于其相應中位數的節點作為核心靶點[7-9]。

3 結果

本研究鑒定得到黃酮類、木脂素類、酚酸類、皂苷類和其他類共5 類30 種化合物，供試品溶液的總離子流圖見圖1，化合物質譜信息見表1。

圖1 供試品溶液總離子流圖Fig.1 Total ion chromatography of test solution

表1 燈盞生脈膠囊鑒定的成分Table 1 Chemical components of Dengzhan Shengmai Capsules

續表1

續表1

3.1 黃酮類

黃酮類化合物廣泛分布于自然界的植物中，是一類具有C6-C3-C6 基本骨架、以2-苯基色原酮為基本骨架衍生而來的化合物，其在質譜條件下的裂解通常圍繞三碳鏈進行，具有相似的裂解規律。本實驗共鑒定得到黃酮類化合物5 種，包括野黃芩苷（11）、木犀草素（16）、芹菜素（18）、山柰酚（19）及甲基麥冬黃酮B（26）。

以總離子流圖中16 號峰為例，該化合物在正離子模式下獲得分子離子峰287.05，經Xcalibur 軟件擬合得到其對應分子式C15H10O6。通過分析其二級質譜譜圖數據得到269.04、153.02、135.04、117.03、89.03 等多個擁有較好響應的碎片離子峰，分別對應[M＋H－H2O]+、[M＋H－C8H6O2]+、[M＋HC7H7O4]+、[M＋H－C7H7O4－H2O]+和[M＋HC7H7O4－H2O－CO]+。經與對照品保留時間及二級碎片離子信息進行對比，并結合對應對照品化合物結構式進行驗證，最終確定16 號峰對應化合物為木犀草素。木犀草素裂解途徑見圖2。

圖2 木犀草素裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathway of luteolin

3.2 木脂素類

藥材五味子中富含木脂素類化合物，此類木脂素通常具有聯苯環辛二烯結構，可在人體內發揮肝保護和抗氧化作用。本實驗共鑒定出木脂素類化合物6 種，包括戈米辛D（22）、戈米辛J（23）、五味子酚（27）、五味子甲素（28）、五味子乙素（29）、五味子丙素（30）。

以總離子流圖中28 號峰為例，該化合物在正離子模式下獲得分子離子峰417.23，經Xcalibur 軟件擬合得到其對應分子式C24H32O6。通過分析其二級質譜譜圖數據得到402.20、386.21、347.15、316.13、301.11、285.11 等多個擁有較好響應的碎片離子峰，分別對應[M＋H－CH3]+、[M＋H－CH3O]+、[M＋H－C5H10]+、[M＋H－C5H10－CH3O]+、[M＋HC5H10－CH3O－CH3]+、[M＋H－C5H10－CH3OCH3O]+。經與對照品保留時間及二級碎片離子信息進行對比，并結合對應對照品化合物結構式進行驗證，最終確定28 號峰對應化合物為五味子甲素。五味子甲素裂解途徑見圖3。

圖3 五味子甲素裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathway of schizandrin A

3.3 酚酸類

酚酸類化合物是在一個苯環上有多個酚羥基取代的芳香羧酸類化合物，其具有很強的抗氧化、抗菌消炎和調血脂等藥理作用。本實驗共鑒定出酚酸類化合物6 種，包括龍膽酸（5）、原兒茶酸（6）、綠原酸（7）、咖啡酸（10）、阿魏酸（12）、水楊酸（15）。

以總離子流圖中7 號峰為例，該化合物在負離子模式下獲得分子離子峰353.09，經Xcalibur 軟件擬合得到其對應分子式C16H18O9。通過分析其二級質譜譜圖數據得到191.06、173.04、161.02、135.04、109.03 等多個擁有較好響應的碎片離子峰，分別對應[M－H－C9H6O3]-、[M－H－C9H6O3－H2O]-、[M－H－C7H12O6]-、[M－H－C7H10O6－CO]-、[MH－C7H10O6－CO－C2H2]-。經與對照品保留時間及二級碎片離子信息進行對比，并結合對應對照品化合物結構式進行驗證，最終確定7 號峰對應化合物為綠原酸。綠原酸的裂解途徑見圖4。

圖4 綠原酸裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathway of chlorogenic acid

3.4 皂苷類

皂苷類化合物是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，其主要分布于陸地高等植物中，具有廣泛的藥理活性[14]。本實驗共鑒定出皂苷類化合物3 種，包括人參皂苷Ro（20）、人參皂苷Rg3（24）、人參皂苷Rg2（25）。

以總離子流圖中24 號峰為例，該化合物在負離子模式下獲得分子離子峰783.49，經Xcalibur 軟件擬合得到其對應分子式C42H72O13。通過分析其二級質譜譜圖數據得到621.44、459.39、375.29、161.04等多個擁有較好響應的碎片離子峰，分別對應[MH－C6H10O5]-、[M－H－C6H10O5－C6H10O5]-、[MH －C6H10O5－C6H10O5－C6H12]-、[M－H －C36H62O8]-。經與對照品保留時間及二級碎片離子信息進行對比，并結合對應對照品化合物結構式進行驗證，最終確定24 號峰對應化合物為人參皂苷Rg3。人參皂苷Rg3的裂解途徑見圖5。

圖5 人參皂苷Rg3 裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathway of ginsenoside Rg3

3.5 其他類

此外，本實驗還從燈盞生脈膠囊中檢測出葡萄糖醛酸、蘋果酸、枸櫞酸、琥珀酸、原兒茶醛、鄰苯二甲酸、咖啡酸甲酯、咖啡酸、燈盞甲素、乙酸松油酯等，相關信息見表1。

3.6 網絡藥理學分析

3.6.1 燈盞生脈膠囊入血成分相關靶點 通過TCMSP 數據庫、STITCH 數據庫及SwissTarget Prediction 數據庫對燈盞生脈膠囊所含成分及相關靶點進行預測，共得到16 個入血成分（琥珀酸、原兒茶酸、綠原酸、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、木犀草素、芹菜素、山柰酚、戈米辛D、戈米辛J、人參皂苷Rg3、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素）及其相關255 個作用靶點，并依此構建了燈盞生脈膠囊的“成分-靶點”相互作用網絡圖（圖6）。該網絡包含271 個節點和500 條邊，其中紅色三角形代表16 個入血成分，綠色矩形代表255 個作用靶點。3.6.2 PPI 網絡的構建

圖6 燈盞生脈膠囊入血成分“成分-靶點”網絡圖Fig.6 “Compound-Target” network of ingredients of Dengzhan Shengmai Capsules in blood

（1）燈盞生脈膠囊“入血成分-靶點”PPI 網絡：燈盞生脈膠囊入血成分靶點的蛋白互作網絡中包含6787 個節點和164 190 條邊，表明有6787 個相互作用蛋白及164 190 種相互作用關系。

（2）心絞痛相關“疾病-靶點”PPI 網絡：利用OMIM 數據庫、TDD 數據庫、GeneCards 數據庫、Disgenet 數據庫對心絞痛相關疾病靶點進行檢索，刪除重復后共得到251 個作用靶點，并依此構建疾病靶點的蛋白互作網絡。在心絞痛相關靶點蛋白互作網絡中有6643 個相互作用蛋白和147 457 條相互作用關系。

3.6.3 核心靶點篩選 為了揭示燈盞生脈膠囊治療心絞痛的藥理學機制，本研究將251 個疾病相關靶點與255 個成分相關作用靶點進行比對，共得到36個燈盞生脈膠囊治療心絞痛的潛在直接作用靶點，包括MAPT、ADRB1、PLAU、TNF、SELP、NOS3、SLC6A2、AR、AKT1、VEGFA、MMP9、IL10、IL6、TP53、MMP1、PPARG、HMOX1、ICAM1、IL2、IFNG、SLC2A4、CD40LG、MMP3、ESR1、SCN5A、F10、F7、SERPINE1、INS、NOS2、F2、SELE、VCAM1、NR3C2、HTR1B 和KCNH2。

此外，將燈盞生脈膠囊“入血成分-靶點”的PPI網絡與心絞痛“疾病-靶點”的PPI 網絡整合取交集，交集網絡中共包含4456 個節點和120 926 條邊；對交集網絡進行拓撲結構分析，degree 值的中位數為33，故選擇degree≥66（2 倍中位數值）的節點作為候選靶點，最終共篩選得到1089 個候選靶點；對候選靶點的相互作用網絡進行提取分析，并以“BC、CC、EC、LAC、NC”分別大于其相應中位數為篩選條件，即BC≥439.461、CC≥0.51、EC≥0.019 3、LAC≥17.961、NC≥19.786，進一步篩選核心靶點，最終得到燈盞生脈膠囊治療心絞痛的核心靶點共368 個。

3.6.4 燈盞生脈膠囊治療心絞痛預測靶點富集分析通過DAVID 對燈盞生脈膠囊治療心絞痛的368 個核心靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路分析。圖7～9 顯示了在生物過程、分子功能和細胞組件中排名前20 的條目。KEGG 富集分析得到燈盞生脈膠囊對心絞痛有顯著影響的通路，表2 列出了P＜0.05 的30 條顯著富集的通路，結果表明，燈盞生脈膠囊治療心絞痛的通路主要有MAPK 信號通路、p53 信號通路等[21-23]。

圖7 燈盞生脈膠囊治療心絞痛的核心靶點的生物過程GO 分析Fig.7 Gene Ontology(GO)biological process analysis on key targets of Dengzhan Shengmai Capsules against angina

圖8 燈盞生脈膠囊治療心絞痛的核心靶點的細胞組件GO 分析Fig.8 Gene Ontology(GO)cellular components analysis on key targets of Dengzhan Shengmai Capsules against angina

圖9 燈盞生脈膠囊治療心絞痛的核心靶點的分子功能GO 分析Fig.9 Gene Ontology(GO)molecular function analysis on key targets of Dengzhan Shengmai Capsules against angina

表2 KEGG 富集分析Table 2 KEGG enrichment analysis

續表2

4 討論

燈盞生脈膠囊對心絞痛療效確切，但對其藥效物質的相關研究匱乏，限制了對其在臨床上精準用藥的指導。本實驗通過對燈盞生脈膠囊進行定性分析，共鑒定得到31 種化合物，包括黃酮類化合物5種、木脂素類化合物6 種、酚酸類化合物6 種、皂苷類化合物3 種和其他類10 種。通過網絡藥理學對其中16 個入血成分進行分析，共得到燈盞生脈膠囊治療心絞痛的368 個核心靶點及MAPK 信號通路和p53 信號通路等主要通路，充分體現了中藥多成分、多靶點、多通路協同作用發揮治療效果的特點。本實驗為探索燈盞生脈膠囊藥效物質基礎提供了新的思路，并為指導臨床合理用藥提供了科學的理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突