復葉地黃連化學成分及其抗煙草花葉病毒活性研究

晏 英，陳 潔，唐 攀，毛遠湖，李 毅，湯 磊，郝小江

1.貴州醫科大學醫藥衛生管理學院，貴州 貴陽 550025

2.貴州醫科大學/貴州省化學合成藥物研發利用工程技術研究中心，貴州 貴陽 550004

3.貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014

植物病毒是危害農作物的一類重要病原，因其危害大、防治困難，素有“植物癌癥”之稱。由于植物病毒對植物細胞的絕對寄生性，病毒復制所需要的物質、能量場所等完全由宿主提供，病毒能夠脅迫宿主細胞的生化機制，使其與病毒本身的生化機制糾纏在一起難以識別，所以藥物難以只對病毒進行選擇性攻擊而不傷害宿主細胞，導致研究高選擇性的化學抗病毒制劑面臨極大的困難，至今仍未取得重大突破。煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）是其中最具代表性的植物病毒，該病毒發現110年以來，已發現可感染的植物高達500 種以上。TMV 是煙草生產上的嚴重病害，煙草及其他農作物感染TMV 后，葉片葉綠素被破壞，光合作用減弱，生長受抑制，造成植株生長困難，畸形、矮化，甚至死亡。TMV 的防治較為困難，可導致農作物減產幅度為20%～80%，全球每年因TMV 造成的損失可達數億美元[1]。煙草病毒病的發生日趨嚴重，尚未出現國際公認的抗TMV 藥物[2]。因此，抗病毒制劑的研發和使用對于防治該病具有重要意義。

目前，傳統的抗病毒制劑往往效果不佳，或者對植物有毒害作用。運用基因工程技術開發轉基因抗病品種，如弱毒疫苗衛星核酸等又存在一定爭議，不容易被采納。植物源活性物質抗病毒效果良好，其治療效果不亞于化學合成制劑，且資源豐富，綠色環保，不會造成環境污染和殘留毒性問題，具有廣闊的發展前景[3]。目前，從植物中分離得到的倍半萜內酯、檸檬苦素、苦木素、石蒜生物堿、3-acetonyl-3-hydroxyoxindole（AHO）等化合物均有很強抗TMV 活性，從植物中分離純化化合物（即天然產物），篩選具有抗病毒活性的化合物，已經被證實是一種有效對抗植物病毒的方法[4-6]。前期，本課題組研究楝科植物復葉地黃連抗TMV 活性成分的過程中，應用TMV 活性追蹤法，分離得到一系列的抗TMV 活性成分檸檬苦素。深入研究發現，該類化合物能誘導植物系統獲得抗性抵御病毒侵染，是潛在的新型植物系統獲得抗性化學誘導劑[7]。此類化合物對TMV 新穎的作用機制，有望突破抗植物病毒劑研究的瓶頸。同時植物中存在的化學防御物質對植物本身的自毒性是較小的，且具備特殊的識別病毒與宿主植物的能力，將有利于發現和研究新的抗病毒制劑。為了繼續尋找抗TMV 的活性化學成分，本研究進一步了開展楝科復葉地黃連植物的化學成分和抗TMV 活性研究。從復葉地黃連的甲醇提取物中分離得到了13 個化合物，分別鑒定為nymania-3（1）、prieurianin（2）、munronin L（3）、12-O-methylvolkensin（4）、12-hydroxyisopimara-8(14),15-dien-7-one（5）、munronin R（6）、3β,4βdihydroxypregnan-16-one（7）、(E)-aglawone-3-one（8）、N-(N-benzoyl-S-phenylalaninyl)-S-phenylalaninol acetate（9）、N-(N-benzoyl-S-phenylalaninyl)-Sphenylalaninol benzoate（10）、glabrol（11）、syringaresinol（12）、7-methoxy-8-hydroxydihydroasarone（13）。其中，化合物5、7～13 為首次從該植物中分離得到。化合物1～3、5、9～12 具有較強的抗TMV 活性。

1 儀器與材料

Bruker AM-400/600 MHz 核磁共振儀、Bruker HTC/Esquire 質譜儀（德國布魯克公司）；高效液相色譜儀為Agilent 1200 型（美國安捷倫科技司）；色譜柱Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國菲羅門公司）；旋轉蒸發儀（東京理化，N-1300D-WD）；BP211D 電子天平（Sartorouius 公司）；高速冷凍離心機（2K15 型，德國Sigma 公司），Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia 公司）；C18反相硅膠（日本YMC 公司）；正相硅膠和薄層色譜板（青島海洋化工廠）；核磁用氘代試劑（美國CIL 氘代試劑），四甲基硅烷（TMS）為內標；液相用水（娃哈哈純凈水）；色譜級甲醇、乙腈（科密歐試劑公司）；其余化學實驗用溶劑為分析純（天津市康科德科技有限公司）。

供試毒源：TMV（U1）普通株系，購于中國科學院武漢病毒研究所。保存于-20 ℃，臨用時取出用0.01 mol/L PB 稀釋至50 μg/mL。供試寄主：心葉煙Nicotiana glutinosa，為TMV 枯斑寄主，普通煙K326Nicotiana tabacumK326，溫室中繁育，種子均購于中國農業科學院煙草研究所。

樣品采自云南省文山州，經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為復葉地黃連Munronia henryiHarms，憑證標本（DHL201511）保存于貴州醫科大學藥學實驗室。

2 方法

2.1 提取與分離

干燥的全株復葉地黃連10 kg，用甲醇回流提取3 次，每次2 h，趁熱濾過，合并提取液，將其濃縮至無醇味得粗提物1043 g，加水混溶成渾濁液體，用醋酸乙酯等體積萃取3 次，回收醋酸乙酯得浸膏。浸膏417 g 經硅膠（100～200 目）柱色譜分離，以石油醚-丙酮體系為洗脫劑進行梯度洗脫（50∶1→30∶70），得到6 個組分Fr.1～6。Fr.3（39.7 g）經C18柱色譜分離，以甲醇-水（40∶60→100∶0）進行梯度洗脫，得到5 個亞組分（Fr.3A～3E）。Fr.3C 經硅膠（200～300 目）柱色譜進行分離，以二氯甲烷-甲醇（30∶1→50∶10）進行梯度洗脫，再經HPLC 制備[甲醇-水（80∶20）]得到化合物1（28.1 mg）、5（10.4 mg）和12（9.3 mg）；Fr.3D 經硅膠（200～300 目）柱色譜進行分離，以石油醚-醋酸乙酯（80∶10→30∶10）進行梯度洗脫，再經凝膠反復柱色譜（甲醇）分離得到化合物4（13.7 mg）和6（15.8 mg）。Fr.4（51.6 g）經C18柱色譜分離，以甲醇-水（50∶50→100∶0）進行梯度洗脫，得到6 個亞組分（Fr.4A～4F）。4B 經硅膠（200～300目）柱色譜進行分離，以石油醚-醋酸乙酯（70∶10→20∶10）進行梯度洗脫，再經HPLC 制備[甲醇-水（73∶27）]得到化合物2（10.9 mg）、3（14.2 mg）和7（8.7 mg）；Fr.4C 經硅膠（200～300 目）柱色譜進行分離，以二氯甲烷-甲醇（20∶1→30∶10）進行梯度洗脫，再經凝膠反復柱色譜（甲醇）分離得到化合物8（24.3 mg）。Fr.5（49.3 g）經C18柱色譜分離，以甲醇-水（60∶40→100∶0）進行梯度洗脫，得到4 個亞組分（Fr.5A～5D）。5B 經硅膠（200～300 目）柱色譜進行分離，以石油醚-醋酸乙酯（50∶10→10∶20）進行梯度洗脫，再經HPLC制備[甲醇-水（65∶35）]得到化合物10（18.4 mg）和11（14.6 mg）；Fr.5D 經硅膠（200～300 目）柱色譜進行分離，以石油醚-醋酸乙酯（40∶10→10∶30）進行梯度洗脫，再經HPLC 制備[甲醇-水（60∶40）]得到化合物9（21.5 mg）和13（7.6 mg）。

2.2 活性篩選

2.2.1 化合物對TMV 的鈍化作用 挑選健康長勢一致的5～6 葉期的心葉煙，暗室放置1 夜。將供試化合物與50 μg/mL 的TMV 按1∶1 比例混合至所需濃度，混勻放置0.5 h。每棵煙挑選大小相似的4～6 片葉子，每片葉子的一半摩擦接種化合物與TMV 的混合溶液100 μL 作為處理組；另一半摩擦接種50 μg/mL 的TMV 100 μL 作為陽性對照組；摩擦接種相應濃度DMSO 溶液的葉片作為空白組[8]。2 h 后用無菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無蟲溫室中，3～4 d 后按公式計算TMV 抑制率，每個化合物重復3 次。

抑制率＝1－處理的平均枯斑數/陽性對照的平均枯斑數

2.2.2 化合物對TMV 的保護作用 挑選健康長勢一致的5～6 葉期的心葉煙，暗室放置1 夜。每棵煙挑選大小相似的4～6 片葉子，供試化合物用無菌水稀釋為所需濃度，每片葉子的一半均勻施藥（化合物）100 μL 作為處理組，24 h 后每片葉子摩擦接種200 μg/mL TMV 200 μL，未施藥的一半作為陽性對照，未施藥且摩擦接種相應濃度DMSO 溶液的葉片作為空白。2 h 后用無菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無蟲溫室中，3～4 d 后按公式計算TMV 抑制率，每個化合物重復3 次。

2.2.3 化合物對TMV 的治療作用 挑選健康長勢一致的5～6 葉期的心葉煙，暗室放置1 夜。每棵煙挑選大小相似的4～6 片葉子摩擦接種200 μg/mL TMV 200 μL，2 h 后每片葉子的一半均勻施藥（化合物）100 μL 作為處理；另一半作為陽性對照；未施藥且摩擦接種相應濃度DMSO 溶液的葉片作為空白。2 h 后用無菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無蟲溫室中，3～4 d 后按公式計算TMV 抑制率，每個化合物重復3 次。

新媒體以勢不可擋的信息技術迅速改變著我們的生活世界，繼而悄悄地然而又深刻地改變著我們所締造的文化世界。不僅僅是改變個體和社會的精神生活方式，而且改變著個體的實體性認同，改變個體與他所處的整個世界的同一性方式和同一性性狀，最后，改變這個世界的精神氣質和精神本質，也就改變著我們的倫理世界。生活世界——文化世界——倫理世界，是新媒體邏輯和歷史地改變世界的三部曲。歸根結底，新媒體改變世界的基礎是賦權，通過賦權賦予傳播內容一定的倫理地位，以全新的傳播和對話方式構建倫理話語和倫理共識，為當下的人類文明發展營造理想的倫理生態。

3 結果

3.1 結構鑒定

化合物1：白色粉末；ESI-MSm/z:593[M＋Na]+，確定相對分子質量為570；分子式C31H38O10；1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.29(1H,s,H-23),7.13(1H,s,H-21),6.95(1H,d,J=16.0 Hz,H-1),6.29(1H,d,J=16.0 Hz,H-2),6.16(1H,s,H-22),5.87(1H,d,J=8.0 Hz,H-12),5.62(1H,dd,J=8.0,12.0 Hz,H-11),5.37(1H,s,H-30b),5.25(1H,s,H-30a),3.89(1H,s,H-15),3.72(3H,s,7-OCH3),3.35(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),3.09(1H,d,J=8.0 Hz,H-9),3.06(1H,dd,J=8.0,12.0 Hz,H-17),2.28(1H,d,J=16.0 Hz,H-6α),2.23(1H,dd,J=6.0,12.0 Hz,H-16α),2.19(1H,dd,J=8.0,16.0 Hz,H-6β),2.17(3H,s,12-OCOCH3),1.87(1H,dd,J=6.0,12.0 Hz,H-16β),1.73(3H,s,OCOCH3-11),1.56(3H,s,H-29),1.30(3H,s,H-19),1.01(3H,s,H-28),0.91(3H,s,H-18)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:173.5(C-7),170.3(12-OCOCH3),169.9(11-OCOCH3),166.6(C-3),148.4(C-1),142.5(C-23),140.2(C-21),136.6(C-8),121.2(C-30),121.1(C-2),122.0(C-20),111.1(C-22),83.5(C-4),74.2(C-12),71.0(C-11),71.0(C-14),59.5(C-15),53.2(C-17),52.3(OCH3-7),49.9(C-5),46.1(C-10),45.0(C-13),37.7(C-9),34.8(C-6),33.4(C-16),30.1(C-29),22.7(C-28),22.2(C-19),20.4(11-OCOCH3),20.3(12-OCOCH3),13.4(C-18)。以上數據與文獻報道基本一致[9]，故鑒定化合物1 為nymania-3。

化合物2：白色粉末；ESI-MSm/z:785[M＋Na]+，確定相對分子質量762；分子式C38H50O16；1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.77(1H,s,COOH-11),7.26(1H,s,H-23),7.19(1H,s,H-21),6.16(1H,s,H-22),6.00(1H,dd,J=10.8,7.2 Hz,H-11),5.73(1H,s,H-1),5.52(1H,d,J=10.8 Hz,H-12),5.52(1H,s,H-30a),4.95(1H,s,H-30b),4.12(1H,d,J=12.0 Hz,H-28β),4.01(1H,m,H-2′),3.97(1H,d,J=12.0 Hz,H-28α),3.69(3H,s,OCH3-7),3.19(1H,d,J=3.0 Hz,H-2),3.14(1H,d,J=7.2 Hz,H-5),3.00(1H,m,H-17),2.99(1H,m,H-17),2.93(1H,s,H-9),2.87(1H,m,H-6α),2.66(1H,m,H-6β),2.28(1H,m,H-16α),2.12(3H,s,28-OCOCH3),2.07(3H,s,1-OCOCH3),2.05(1H,m,H-16β),2.00(1H,m,H-3′),1.48(1H,s,H-29),1.46(1H,m,H-4′α),1.17(1H,m,H-4′β),0.86(3H,d,J=6.0 Hz,H-5′),0.84(3H,s,H-19),0.83(3H,s,H-18),0.74(3H,t,J=6.6 Hz,H-6′)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:206.2(C-15),174.9(C-7),170.2(C-3),169.6(28-OCOCH3),169.6(1-OCOCH3),168.5(C-1′),160.3(COOH-11),143.1(C-23),140.6(C-21),137.8(C-8),125.6(C-30),122.9(C-20),110.5(C-22),84.4(C-4),80.8(C-1),74.7(C-14),73.9(C-2′),71.4(C-11),71.4(C-12),69.7(C-28),53.4(OCH3-7),51.3(C-9),51.3(C-5),49.7(C-13),46.7(C-10),41.4(C-16),38.0(C-3′),36.9(C-17),35.2(C-2),32.8(C-6),25.9(C-29),23.0(C-5′),22.9(28-OCOCH3),20.7(1-OCOCH3),15.2(C-19),15.2(C-4′),13.0(C-18),11.5(C-6′)。以上數據與文獻報道基本一致[10]，故鑒定化合物2 為prieurianin。

化合物3：白色粉末；ESI-MSm/z:621[M＋Na]+，確定相對分子質量598；分子式C34H46O9；1HNMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.33(1H,s,H-23),7.15(1H,s,H-21),6.96(1H,m,H-3′),6.07(1H,s,H-22),5.15(1H,t,J=7.6 Hz,H-15),4.95(1H,t,J=3.4 Hz,H-3),4.80(1H,m,H-1),4.80(1H,m,H-7),4.11(1H,d,J=2.8 Hz,H-6),4.08(1H,m,H-12),3.61(1H,s,H-28),3.53(1H,d,J=8.8 Hz,H-17),3.21(3H,s,OCH3-12),2.86(1H,d,J=12.8 Hz,H-5),2.74(1H,d,J=8.4 Hz,H-9),2.20(1H,m,H-16α),2.06(1H,m,H-2α),2.06(1H,m,H-2β),2.02(1H,m,H-16β),1.92(3H,s,3-OCOCH3),1.91(1H,s,H-5′),1.85(3H,d,J=6.8 Hz,H-18),1.82(1H,d,J=6.8 Hz,H-4′),1.63(1H,m,H-11),1.19(1H,s,H-29),1.19(1H,s,H-30),1.91(1H,s,H-5′),0.96(3H,s,H-19)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:170.3(OCOCH3-3),166.8(C-1′),143.3(C-23),142.0(C-13),138.8(C-21),138.4(C-3′),136.7(C-14),128.6(C-2′),128.1(C-20),109.7(C-22),101.3(C-12),77.8(C-28),75.0(C-15),73.8(C-6),71.6(C-1),71.5(C-3),70.7(C-7),54.9(OCH3-12),49.7(C-8),44.8(C-17),42.7(C-4),40.8(C-10),38.8(C-5),38.2(C-16),35.2(C-9),28.4(C-11),27.7(C-2),20.9(OCOCH3-3),20.4(C-30),19.3(C-29),16.6(C-19),16.4(C-18),14.6(C-4′),12.0(C-5′)。以上數據與文獻報道基本一致[11]，故鑒定化合物3 為munronin L。

化合物4：白色粉末；ESI-MSm/z:621[M＋Na]+，確定相對分子質量598；分子式C34H46O9；1HNMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.31(1H,s,H-23),7.28(1H,s,H-21),6.97(1H,dd,J=7.2,6.0 Hz,H-3′),6.42(1H,s,H-22),4.96(1H,m,H-15),4.95(1H,d,J=3.0 Hz,H-3),4.74(1H,t,J=2.6 Hz,H-1),4.61(1H,s,H-12),4.37(1H,d,J=2.4 Hz,H-7),4.06(1H,dd,J=12.6,2.4 Hz,H-6),3.60(1H,d,J=7.2 Hz,H-28β),3.59(1H,d,J=7.2 Hz,H-28α),3.44(1H,d,J=9.0 Hz,H-17),3.18(1H,d,J=10.2 Hz,H-9),3.06(3H,s,OCH3-12),2.90(1H,d,J=12.6 Hz,H-5),2.60(1H,m,H-16α),2.24(1H,m,H-2β),2.17(1H,m,H-2α),2.01(3H,s,3-OCOCH3),1.95(1H,d,J=6.6 Hz,H-5′),1.83(1H,d,J=7.2 Hz,H-4′),1.77(1H,m,H-11α),1.76(3H,s,H-18),1.64(1H,m,H-16β),1.60(1H,m,H-11β),1.35(1H,s,H-30),1.20(1H,s,H-29),0.96(3H,s,H-19)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:170.5(3-OCOCH3),167.0(C-1′),144.7(C-14),143.0(C-23),139.3(C-21),139.1(C-13),136.8(C-3′),129.6(C-2′),128.9(C-20),110.7(C-22),98.2(C-12),78.2(C-28),77.0(C-15),74.1(C-6),73.6(C-7),71.8(C-3),71.0(C-1),54.1(OCH3-12),47.0(C-17),46.3(C-8),42.9(C-4),40.9(C-10),38.7(C-5),38.1(C-11),35.0(C-9),31.7(C-16),27.9(C-2),21.1(3-OCOCH3),20.9(C-30),19.9(C-29),16.3(C-18),16.3(C-19),14.4(C-4′),12.1(C-5′)。以上數據與文獻報道基本一致[12]，故鑒定化合物4 為12-O-methylvolkensin。

化合物5：白色粉末；ESI-MSm/z:415[M＋Na]+，確定相對分子質量392；分子式C25H28O4；1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.57(1H,d,J=2.7 Hz,H-14),5.84(1H,dd,J=10.8,17.6 Hz,H-15),5.19(1H,dd,J=0.8,10.8 Hz,H-16b),5.18(1H,dd,J=0.8,17.6 Hz,H-16a),3.71(1H,dd,J=3.6,12.0 Hz,H-12),2.57(1H,dd,J=4.8,18.4 Hz,H-6α),2.28(1H,d,J=17.6 Hz,H-9),2.26(1H,d,J=18.4 Hz,H-6α),1.86(1H,m,H-11β),1.76(1H,m,H-1β),1.56(1H,m,H-11α),1.55(1H,m,H-3β),1.54(1H,m,H-2),1.52(1H,m,H-5),1.20(1H,m,H-3α),1.19(1H,m,H-1α),1.09(3H,s,H-17),0.88(3H,s,H-19),0.85(3H,s,H-18),0.85(3H,s,H-20)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:200.7(C-7),143.5(C-15),142.9(C-14),135.1(C-8),115.1(C-16),73.2(C-12),51.2(C-9),50.4(C-5),44.0(C-4),41.7(C-3),38.7(C-1),37.5(C-6),36.2(C-10),33.2(C-13),32.6(C-18),26.7(C-11),21.1(C-19),18.6(C-2),17.9(C-17),13.8(C-20)。以上數據與文獻報道基本一致[13]，故鑒定化合物5 為12-hydroxyisopimara-8(14),15-dien-7-one。

化合物6：白色粉末；ESI-MSm/z:373[M＋Na]+，確定相對分子質量350；分子式C21H34O4；1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ:5.70(1H,s,H-14),4.24(1H,s,H-6),3.71(1H,d,J=5.2 Hz,H-7),3.71(3H,s,OCH3-15),2.23(1H,m,H-12β),2.21(1H,m,H-11β),2.20(1H,m,H-12α),2.19(1H,m,H-16),2.18(1H,m,H-11α),1.81(3H,s,H-17),1.76(1H,m,H-1β),1.56(1H,m,H-2),1.43(1H,m,H-3β),1.37(1H,m,H-5),1.31(3H,s,H-18),1.21(1H,m,H-3α),1.21(3H,s,H-19),1.15(1H,m,H-1α),1.02(3H,s,H-20)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:167.4(C-15),160.5(C-13),145.7(C-9),125.2(C-8),115.0(C-14),76.3(C-7),71.9(C-6),51.1(OCH3-15),49.5(C-5),43.0(C-3),40.8(C-12),39.7(C-10),39.5(C-1),33.9(C-20),33.7(C-4),26.7(C-11),24.4(C-19),21.7(C-18),19.3(C-2),19.1(C-16),18.1(C-17)。以上數據與文獻報道基本一致[14]，故鑒定化合物6 為munronin R。

化合物8：白色粉末；ESI-MSm/z:337[M＋Na]+，確定相對分子質量314；分子式C21H30O2；1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.53(1H,q,J=8.0 Hz,H-20),2.25(1H,m,H-12α),2.18(1H,dd,J=7.6,17.0Hz,H-15α),1.97(1H,dd,J=14.6,17.0 Hz,H-15β),1.86(3H,d,J=8.0 Hz,H-21),1.76(1H,m,H-2α),1.73(1H,m,H-11α),1.72(1H,m,H-8),1.70(1H,m,H-1α),1.69(1H,m,H-7α),1.68(1H,m,H-4α),1.65(1H,m,H-12β),1.48(1H,m,H-11β),1.46(1H,m,H-14),1.35(1H,m,H-5),1.33(1H,m,H-2β),1.30(1H,m,H-4β),1.06(3H,s,H-18),1.04(3H,s,H-19),0.97(1H,m,H-1β),0.91(1H,m,H-7β),0.89(1H,m,H-9)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:211.6(C-3),206.2(C-16),147.7(C-17),129.2(C-20),53.4(C-9),49.8(C-14),46.5(C-5),44.5(C-4),43.3(C-13),38.1(C-12),38.0(C-15),37.8(C-2),36.1(C-1),35.7(C-10),34.0(C-8),31.6(C-7),28.6(C-6),21.1(C-11),17.6(C-18),13.2(C-21),11.4(C-19)。以上數據與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物8 為(E)-aglawone-3-one。

化合物9：白色粉末；ESI-MSm/z:467[M＋Na]+，確定相對分子質量444；分子式C27H28N2O4；1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.76(2H,d,J=6.0 Hz,H-2′,6′),7.56(1H,t,J=7.2 Hz,H-4′),7.48(2H,t,J=7.6 Hz,H-3′,5′),7.33～7.09(10H,m,H-2′′～6′′,2′′′～6′′′),6.77(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),5.98(1H,d,J=9.6 Hz,H-5),4.80(1H,m,H-7),4.37(1H,m,H-4),3.97(1H,dd,J=12.0,4.8 Hz,H-3β),3.85(1H,dd,J=12.0,4.8 Hz,H-3α),3.26(1H,dd,J=12.0,6.0 Hz,H-10β),3.10(1H,dd,J=12.0,6.0 Hz,H-10α),2.81(2H,m,H-11),2.05(3H,s,H-1)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:170.8(C-2),170.2(C-6),167.1(C-9),136.7(C-1′′),136.6(C-1′′′),133.6(C-1′),131.9(C-4′),129.3(C-3′′),129.3(C-5′′),129.3(C-3′),129.3(C-5′),129.1(C-3′′′),129.1(C-5′′′),128.8(C-2′′),128.8(C-6′′),128.6(C-2′),128.6(C-6′),128.6(C-2′′′),128.6(C-6′′′),127.2(C-4′′),126.8(C-4′′′),64.6(C-3),55.0(C-7),49.4(C-4),38.4(C-10),37.4(C-10),20.8(C-1)。以上數據與文獻報道基本一致[17]，故鑒定化合 物 9 為N-(N-benzoyl-S-phenylalaninyl)-Sphenylalaninol acetate。

化合物10：白色粉末；ESI-MSm/z529[M＋Na]+，確定相對分子質量506；分子式C32H30N2O4；1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.71(1H,d,J=7.2 Hz,H-2′),7.69(1H,d,J=7.2 Hz,H-6′),7.67(1H,d,J=7.2 Hz,H-2′′′′),7.65(1H,d,J=7.2 Hz,H-6′′′′),7.53(1H,t,J=7.6 Hz,H-4′′′′),7.21～7.46(16H,m,H-3′～5′,2′′～6′′,2′′′～6′′′,3′′′′～5′′′′),6.70(1H,d,J=8.4 Hz,H-4),6.59(1H,d,J=6.4 Hz,H-7),4.94(1H,q,J=6.8 Hz,H-6),4.63(1H,m,H-3),4.05(1H,dd,J=4.4,11.6 Hz,H-2),3.32(1H,dd,J=6.4,14.0 Hz,H-10)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:171.9(C-5),167.4(C-8),167.2(C-1),137.1(C-1′′′),135.7(C-1′′),134.1(C-1′),133.2(C-1′′′′),132.0(C-4′′′′),131.4(C-4′),129.3(C-3′′),129.3(C-3′′′),129.1(C-5′′),129.1(C-5′′′),128.8(C-6′′′′),128.8(C-6′′′),128.8(C-2′′),128.7(C-2′′′′),128.7(C-2′′′),128.7(C-6′′),128.6(C-6′),128.4(C-2′),127.4(C-4′′),127.1(C-5′),127.1(C-3′′′′),127.1(C-5′′′′),127.0(C-3′),126.8(C-4′′′),65.3(C-2),54.5(C-6),50.2(C-3),37.5(C-9),37.2(C-10)。以上數據與文獻報道基本一致[18]，故鑒定化合物10 為N-(N-benzoyl-S-phenylalaninyl)-S-phenylalaninol benzoate。

化合物11：黃色粉末；ESI-MSm/z:415[M＋Na]+，確定相對分子質量392；分子式C25H28O4；1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.76(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),7.07(1H,s,H-6),7.07(1H,s,H-6′),6.55(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.20(1H,s,H-2′),5.36(1H,dd,J=3.2,12.8 Hz,H-2),5.36(1H,t,J=6.0 Hz,H-2′′′),5.35(1H,t,J=6.0 Hz,H-2′′),3.43(2H,d,J=7.2 Hz,H-1′′′),3.38(2H,d,J=7.2 Hz,H-1′′),3.04(1H,dd,J=3.0,16.8 Hz,H-3β),2.83(1H,dd,J=7.2,16.8 Hz,H-3α),1.78(3H,s,H-4′′′),1.78(3H,s,H-5′′′),1.74(3H,s,H-4′′),1.74(3H,s,H-5′′)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:191.7(C-4),161.3(C-7),160.9(C-8a),152.9(C-4′),135.2(C-3′′′),134.7(C-3′′),130.7(C-1′),127.3(C-2′),127.3(C-3′),126.5(C-5),125.7(C-6),125.7(C-6′),121.7(C-2′′),121.0(C-2′′′),115.0(C-8),114.5(C-4a),110.4(C-5′),79.7(C-2),44.1(C-3),29.7(C-1′′′),25.8(C-4′′),25.8(C-4′′′),22.3(C-1′′),17.9(C-5′′),17.9(C-5′′′)。以上數據與文獻報道基本一致[19]，故鑒定化合物11 為glabrol。

化合物12：白色粉末；ESI-MS：m/z441[M＋Na]+，確定相對分子質量418；分子式C22H26O8；1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:6.60(1H,s,H-2′),6.60(1H,s,H-2′′),6.60(1H,s,H-6′),6.60(1H,s,H-6′′),4.75(1H,d,J=3.4 Hz,H-2),4.75(1H,d,J=3.4 Hz,H-6),4.32(1H,dd,J=7.2,5.5 Hz,H-4α),4.32(1H,dd,J=7.2,5.5 Hz,H-8α),3.94(6H,s,3′,3′′-OCH3),3.92(3H,s,5′-OCH3),3.91(3H,s,5′′-OCH3),3.85(1H,m,H-4β),3.85(1H,m,H-8β)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:147.2(C-5′),147.2(C-5′′),147.2(C-3′),147.2(C-3′′),134.3(C-4′),134.3(C-4′′),132.1(C-1′),132.1(C-1′′),102.7(C-2′),102.7(C-2′′),102.7(C-6′),102.7(C-6′′),86.1(C-2),86.1(C-6),71.8(C-4),71.8(C-8),56.4(3′-OCH3),56.4(3′′-OCH3),56.4(5′-OCH3),56.4(5′′-OCH3),54.4(C-1),54.4(C-5)。以上數據與文獻報道基本一致[20]，故鑒定化合物12 為syringaresinol。

化合物13：白色粉末；ESI-MSm/z:279[M＋Na]+，確定相對分子質量256；分子式C13H20O5；1HNMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.90(1H,s,H-6),6.53(1H,s,H-3),4.42(1H,d,J=6.0 Hz,H-7),3.85(3H,s,4-OCH3),3.83(3H,s,5-OCH3),3.81(1H,s,H-8),3.78(3H,s,2-OCH3),3.23(3H,s,7-OCH3),1.01(1H,d,J=6.4 Hz,H-9)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:152.7(C-2),149.3(C-4),143.6(C-5),118.3(C-1),111.1(C-6),97.4(C-3),81.7(C-7),71.8(C-8),57.4(7-OCH3),56.7(2-OCH3),56.7(5-OCH3),56.3(4-OCH3),18.0(C-9)。以上數據與文獻報道基本一致[21]，故鑒定化合物13 為7-methoxy-8-hydroxydihydroasarone。

3.2 抗TMV 活性實驗結果

復葉地黃連全株中分離得到的化合物1～13 的抗TMV 活性結果見表1，從鈍化活性結果來看，化合物1～3、5、9～12 的抑制率高于寧南霉素，表明這些化合物在體外能作用于病毒；從保護活性來看，化合物1、3、4、10、11 高于寧南霉素，化合物2、5 與寧南霉素相當，其余化合物均低于寧南霉素，表明化合物1～5、10、11 能誘導煙草獲得植物系統抗性抵御病毒；從治療活性來看，化合物1、4、5、11 高于寧南霉素，化合物2、3、9、12 和寧南霉素相當，表明化合物1～5、9、11、12 能直接作用于病毒，不影響宿主細胞；從鈍化活性的IC50值結果來看，化合物1、2、3、5、9～12 具有較強的抗TMV 活性。結果顯示檸檬苦素類化合物除了能誘導煙草獲得植物系統抗性抵御病毒，同時能作用于病毒，從結構上看，化合物1 和2 屬于A,B 環開裂的檸檬苦素，化合物3 和4 屬于C 環開裂的檸檬苦素，說明不同結構類型的檸檬苦素抗植物病毒能力不同。二萜化合物、二肽類化合物、黃酮化合物既能誘導煙草獲得植物系統抗性抵御病毒，也能作用于病毒，具有較強的抗植物病毒能力，豐富抗植物病毒化合物結構多樣性。

表1 化合物1～13 的抗TMV 活性Table 1 Antiviral activities of compounds 1?13 against tobacco mosaic virus

4 討論

通過應用多種色譜方法從楝科植物復葉地黃連全株的甲醇提取物中分離得到13 個單體化合物，化合物5、7～13 為首次從該植物中分離得到。對化合物1～13 進行抗TMV 活性測試，發現化合物1～3、5、9～12 具有較強的抗TMV 活性，其活性高于陽性對照藥物寧南霉素。檸檬苦素類化合物、二萜化合物、二肽類化合物、黃酮化合物既能誘導煙草獲得植物系統抗性抵御病毒，也能作用于病毒，具有較強的抗植物病毒能力，檸檬苦素類化合物抗植物病毒活性可能和骨架類型緊密相關。本研究結果豐富了復葉地黃連的化學成分及生物活性內容，為其進一步的研究開發奠定了理論基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突