Micro R NA-519d-3p對肝星狀細胞活化及凋亡的影響

武彥虎，丁向春，王 釗，馮薛煙，汪彭濤，海 龍

（1.寧夏醫科大學，銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院感染疾病科，銀川 750004；3.寧夏醫科大學總醫院病原微生物實驗室，銀川 750004）

肝纖維化主要由慢性病毒性乙型或丙型肝炎、自身免疫性疾病、膽道疾病、酒精性脂肪性肝炎和越來越多的非酒精性脂肪性肝炎引起的一種肝內慢性可逆性損傷修復反應[1]。肝星狀細胞（HSC）的激活是肝纖維化發生發展的主要效應細胞，HSC的激活與增殖分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成，肝內細胞外基質的過度積累，如果得不到有效治療，最終可導致嚴重的肝衰竭及各種終末期肝臟疾病[2]。miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過與靶基因miRNA序列3'末端非翻譯區（3'UTR）互補配對，阻止其蛋白質翻譯而起到轉錄后抑制作用[3]。miRNA在生長發育、細胞分化、增殖、凋亡、腫瘤發生等過程中發揮重要作用，研究[4]表明，miRNA通過調控靶基因及其相關信號通路，在HSC活化、肝纖維化相關細胞的調控以及肝纖維化發生發展中都起到了極其重要的作用。miR-519d-3p是一種新發現的具有腫瘤抑制作用的miRNA，近期研究發現，miR-519d-3p在肝星狀細胞活化過程中的表達異常，本研究通過體外轉染技術，將miR-519d-3p模擬物及其抑制劑轉染LX-2細胞（人肝星狀細胞系），探討miR-519d-3p對HSC活化和凋亡的影響，為抗肝纖維化的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Dulbeccos Modified Eagle Medium（DMEM培養基）（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；胰蛋白酶消化液（美國Gibco公司）；細胞全蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒（凱基公司）；異丙醇、甲醇、乙醇、脫脂奶粉（BD公司）；PVDF膜（Milipore Corporation）；SYNERGY2型 酶 標 儀（美國BioTek公司）；實時熒光定量PCR系統（Roche公司）；Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑（Invitrogen公司）；RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］；逆轉錄試劑盒（Thermo公司）；SYBR染色法實時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司）；引物（Sangon Biotech公司）；miR-519d-3p模擬物、抑制物及陰性對照序列（上海吉瑪制藥技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將LX-2細胞從-150℃冰箱取出用含10%胎牛血清DMEM培養基（100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素）在10 cm2培養皿中，37℃、5%CO2培養箱中培養，換液，傳代，取3至6代細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉染 將miR-519d-3p模擬物（mimics）、miR-519d-3p模擬物對照物（mimics NC）、miR-519d-3p抑制物（inhibitor）、miR-519d-3p抑制物對照物（inhibitor NC）染LX-2細胞，同時設置未轉染的LX-2細胞作為對照組（con）。將LX-2細胞培養至對數生長期，胰酶消化后細胞計數，將HSC-LX2以5×105細胞接種于6孔板內（96孔板每孔細胞數為2×103個），用不含雙抗10%胎牛血清的DMEM培養基培養，每孔2 mL。次日，顯微鏡下觀察細胞密度60%～80%后，開始進行轉染實驗，轉染步驟按Lipofectamine RNAi MAX轉染試劑和miR-519d-3p合成說明書操作：吸取8μL Lipofectamine RNAi MAX，8μL化學合成的miR-519d-3p，分別加入含150μL opti-MEM的1.5 mL eppendorf管中，然后將二者混合，室溫靜置5 min，分別加入6孔板對應孔中，每孔250μL（96孔板每孔10μL），置于37℃、5%CO2培養箱中培養1～3 d，分析轉染效率。

1.2.3 Real-time PCR檢測LX-2細胞miR-519d-3p相對表達量及α-SMA I和Collagen ImRNA表達水平 將細胞按1.2.2方法處理，37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒提取cDNA、SYBR熒光定量PCR試劑盒進行操作及分析。轉染及Real-time PCR所用序列如表1所示，實驗結果采用2-ΔΔCt法計算α-SMA及Collagen ImRNA的相對表達量。

表1 轉染所用miRNAs及Real-time PCR所用序列

1.2.4 Western blot檢測LX-2細胞α-SMA和CollagenⅠ的蛋白表達 按1.2.2方法將LX-2細胞種植在6孔板進行細胞轉染，48 h后，提取細胞總蛋白，測蛋白濃度，煮蛋白，以40μg/20μL對蛋白樣品進行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，轉膜1.5 h，封閉1 h，一抗孵育過夜12 h，用TBST溶液洗滌一抗5 min，重復5次，二抗孵育1 h，用TBST溶液洗滌二抗5 min，重復5次，imaging system顯影。本實驗平行重復3次。

1.2.5 流式細胞術檢測miR-519d-3p對LX-2細胞凋亡的影響 按1.2.2方法將LX-2細胞種植在6孔板進行細胞轉染，48 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，用PBS洗滌細胞二次（2000 r·min-1離心5 min）收集細胞，在50μL的Binding Buffer中加入5μL 7-AAD染液，混勻；收集細胞中加入上述7-AAD染液，混勻；室溫避光反應10 min；反應后再加入450μL的Binding Buffer混勻；加入1μL Annexin V-PE混勻；室溫避光反應10 min；用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染LX-2細胞后miR-519d-3p的表達

利用Real-time PCR檢測各組LX-2細胞中miR-519d-3p相對表達水平。miR-519d-3p mimics組的miR-519d-3p相對表達量高于con與mimics NC組（P均＜0.01）；miR-519d-3p inhibitor組的miR-519d-3p相對表達量低于con與inhibitor NC組（P均＜0.01），見圖1。

圖1 轉染miR-519d-3p mimics與inhibitor的LX-2細胞中miR-519d-3p的相對表達水平比較

2.2 miR-519d-3p對LX-2細胞活化的影響

Real-time PCR檢測轉染的LX-2細胞中活化標志物α-SMA和Collagen I mRNA表達水平變化。結果顯示，與mimics NC組相比，過表達miR-519d-3p能抑制α-SMA和Col lagen ImRNA表達，有抑制肝星狀細胞激活的作用（P均＜0.01）；與inhibitor NC組相比，下調miR-519d-3p促進α-SMA和Collagen ImRNA表達，有促進肝星狀細胞激活的作用（P均＜0.01），見圖2、圖3。

圖2 Real-time PCR檢測轉染的LX-2細胞中Collagen I mRNA表達水平比較

圖3 Real-time PCR檢測轉染的LX-2細胞中α-SMA mRNA表達水平比較

2.3 Western blot檢測轉染的LX-2細胞中α-SMA和CollagenⅠ蛋白水平變化

結果顯示，與mimics NC組相比，過表達miR-519d-3p可以抑制α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達，具有抑制肝星狀細胞激活的作用（P均＜0.01）；與inhibitor NC組相比，下調miR-519d-3p促進α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達，具有促進肝星狀細胞激活的作用（P均＜0.01），見圖4。

2.4 miR-519d-3p對LX-2細胞凋亡的影響

miR-519d-3p mimics和inhibitor轉染LX-2細胞48 h后，采用AnnexinV-PE/7-AAD細胞凋亡試劑盒進行凋亡檢測結果顯示，與mimics NC組相比，miR-519d-3p mimics組可以促進LX-2細胞的凋亡（P均＜0.01）；與inhibitor NC組相比，miR-519d-3p inhibitor組可以抑制LX-2細胞的凋亡（P均＜0.01），見圖5。

3 討論

圖4 Western blot檢測轉染的LX-2細胞中活化標志物CollagenⅠ和α-SMA蛋白表達水平情況

圖5 流式細胞儀檢測miR-519d-3p對LX-2細胞凋亡的影響

miRNA是一種與肝纖維化發生發展有密切關系的微小RNA。研究表明，越來越多的miRNA被發現在肝纖維化或者HSC活化過程中異常表達，如miR-134、miR-335、miR-126在肝纖維化的過程中表達下調，具有抑制HSC的激活或者增殖作用；miR-10a、miR-34、miR-21在肝纖維化的過程中表達上調，具有促進HSC的激活或增殖作用。據文獻[5]報道，miR-519d-3p在多種腫瘤的發生發展中起著重要作用，在胰腺癌中，核糖體蛋白S15A（RPS15A）是一種各種人類癌癥的新型致癌基因，RPS15A表達在胰腺癌細胞系中顯著上調，RPS15A被鑒定為miR-519d-3p的靶基因，過表達miR-519d-3p通過抑制RPS15A介導的Wnt/β-連環蛋白信號傳導來抑制胰腺癌細胞的生長；在前列腺腫瘤中，miR-519d-3p在前列腺癌細胞中低表達，過表達miR-519d-3p通過降低DU-145前列腺癌細胞腫瘤壞死因子受體相關因子4（TRAF4）水平抑制其增殖[6]；在結直腸腫瘤中miR-519d-3p通過靶向營養素相關蛋白（TROAP）在結直腸癌中抑制細胞增殖和遷移[7]；在宮頸癌中，miR-519d-3p靶向缺氧誘導因子（HIF-2α）抑制宮頸癌細胞增殖和促進細胞凋亡[8]；在乳腺腫瘤中，miR-519d-3p通過靶向LIM域激酶1抑制乳腺癌細胞的生長和運動[9]。在滋養細胞中，miR-519d-3p通過靶向MMP-2抑制滋養細胞的遷移和侵襲[10]；在胃癌中，MiR-519d-3p通過下調B細胞淋巴瘤6（bcl6）抑制胃癌細胞增殖和侵襲[11]。然而，miR-519d-3p對肝星狀胞的生物學功能及作用機制的研究還未見國內外報道。肝纖維化是各種終末期肝臟疾病必經階段，其主要病理改變是細胞外基質的合成和降解失衡，從而引起細胞外基質的大量堆積，最終導致肝纖維化；HSC是肝纖維發生發展的中心環節，是細胞外基質的主要來源細胞，當肝臟受到各種原因引起刺激時，HSC將由靜息狀態激活并大量增殖，從而導致細胞外基質增加。另外，α-SMA和CollagenⅠ是細胞外基質的主要成分，因此，檢測LX-2細胞活化標志物α-SMA和CollagenⅠ含量變化，可以間接反應肝纖維化的逆轉情況。本實驗通過體外轉染miR-519d-3p的模擬物和抑制劑來研究miRNA對HSC株LX-2活化和凋亡的影響。研究表明:miR-519d-3p mimics和inhibitor分別轉染LX-2細胞后，Real-time PCR和Western Blot結果顯示，轉染miR-519d-3p mimics組α-SMA和CollagenⅠmRNA和蛋白表達降低，轉染inhibitor組α-SMA和CollagenⅠmRNA和蛋白水平表達增加。另一方面，將miR-519d-3p mimics轉染LX-2細胞后，可以促進細胞凋亡，而將miR-519d-3p inhibitor轉染LX-2細胞后，可以抑制細胞的凋亡。綜上所述，miR-519d-3p在HSC活化過程中具有抑制作用，可以促進HSC的凋亡，抑制肝纖維化的進展，為肝纖維化的治療指明了新的方向。