甘草酸對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞T G F-β1/S m ads信號通路的影響

冉 喆，王玉軍，王 珍，趙天琪，侯紹章

（寧夏醫科大學基礎醫學院病理學系，銀川 750004）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，國際糖尿病聯盟組織近日調查顯示，在我國有20%～40%的糖尿病患者并發DN[1]。與系膜細胞增殖相關的細胞外基質（extracelluar matrix，ECM）積聚是DN的主要病理變化之一，在DN病變初期，活化的腎小球系膜細胞即發生增殖，并分泌大量細胞因子影響ECM合成、分解平衡，逐漸引起ECM大量沉積，導致腎小球硬化、腎纖維化的形成[2-3]。因此，對腎小球系膜細胞功能的監測在糖尿病腎病的早期診斷和治療中具有重要意義。在眾多影響腎纖維化的信號通路中，轉化因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smads信號通路是誘導腎纖維化進程中最重要的信號通路[4]，高糖刺激可以導致腎小球系膜細胞TGF-β1表達增加，引起下游受體調節Smads（R-Smads）的激活，進而增加ECM相關蛋白的表達，并抑制ECM的降解，導致腎臟纖維化[5]。因此，通過阻斷TGF-β1-Smads信號通路可以有效預防DN的進展。近年來，甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）在抗腎纖維化及DN保護領域取得了長足進展，得到了廣大學者的認可。Hou等[6]研究發現，在糖尿病大鼠模型中，GA可以通過抑制氧化應激對DN起防治作用。GA也可以通過提高Mn-SOD的表達減緩高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷[7]。然而，GA對于高糖誘導的腎小球系膜細胞的影響及其作用機制尚未明確。因此，本實驗通過高糖誘導的腎小球系膜細胞模擬體內環境，觀察GA對TGF-β1-Smads信號通路蛋白表達的影響，以探討GA對DN腎臟保護作用機制，為GA在商業領域的應用和推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

MCs SV40 MES13細胞購自武漢普羅塞爾公司（中國），胰蛋白酶EDTA（鈣二鈉）、胎牛血清（FBS）購自Hyclone實驗室公司（美國），D-葡萄糖粉末購自Sigma（美國），BCA蛋白測定試劑盒購自上海碧云天生物工程研究所（中國）。6 cm皿、24孔細胞培養器、96孔細胞培養器和吸管均購自NEST GROUP公司（中國），GA購自北京索萊寶公司（中國），CCK-8試劑盒購自同仁化學研究所（日本）。抗TGF-β1來自Abcam公司（美國），抗P-Smad3、P-Smad2、COLⅠ、COLⅣ購自Affinity Biosciences（中國）。ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司（中國）。分光光度儀購自BioTek（美國），聚偏氟乙烯膜（PVDF）購自Millipore公司（美國），BSA購自中山金橋（中國），FITC（異硫氰酸熒光素）-共軛二級抗體購自Abbkine（中國）。凝膠成像系統購自Bio-RAD公司（美國）。奧林巴斯FV1000激光掃描共焦顯微鏡購自奧林巴斯（美國）。

1.2 細胞培養及實驗分組

將MCs SV40 MES13細胞放在DMEM（Dulbecco改良的Eagle培養基）中培養，并添加10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素（37℃、5%CO2）孵育17 h。然后將細胞分為低糖對照（NG）組（5.6 mmol·L-1葡萄糖）、高糖（HG）組（30 mmol·L-1葡萄糖）和高糖GA（HG+GA）組（30 mmol·L-1葡萄糖+200μmol·L-1GA），分別培養48 h。

1.3 CCK-8法檢測細胞活性

將細胞密度調整為5×104個/mL后接種于96孔板中，每孔100μL。在37℃溫箱培育17 h待細胞狀態穩定后，進行分組干預48 h。每孔分別加入10μL CCK-8，在37℃溫箱避光孵育2 h后使用分光光度儀在495 nm處測量光密度（OD）值。

1.4 HE染色觀察細胞形態

將1.5×104個細胞接種在玻璃片上，在37℃溫箱中培育17 h，待細胞狀態穩定后，進行分組干預48 h。干預結束后，將各組細胞依次用75%乙醇固定、蘇木精-伊紅染色，再采用光學顯微鏡來觀察細胞密度和基本形態。

1.5 Western blot檢測細胞中TGF-β1、P-Smad3、P-Smad2、COLⅠ、COLⅣ的表達

干預48 h后，用冷磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3次，冰上裂解提取全蛋白。BCA法檢測蛋白濃度，然后將蛋白重新分裝。將蛋白質提取物從十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）轉移到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，然后進行一抗孵育，抗TGF-β1（1∶500）、抗P-Smad3（1∶1000）、抗P-Smad2（1∶1000）、抗-COLⅠ、COLⅣ、抗GADPH（1∶5000）4℃過夜，次日，二抗常溫孵育，在暗視野中使用ECL發光液，采用凝膠成像系統對信號進行定量，從而測定TGF-β1、P-Smad3、P-Smad2、COLⅠ、COLⅣ蛋白的相對表達量。

1.6 細胞免疫熒光檢測P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ的表達

將細胞在玻璃蓋上培養，待細胞狀態穩定后進行分組處理48 h。48 h后采用4.0%多聚甲醛進行細胞固定。用PBS洗滌3次，0.1%TritonX-100處理20 min，在室溫下用10%BSA封閉1 h，在4℃下與抗P-Smad3（1∶400）、抗COLⅠ、COLⅣ孵育過夜。次日，在常溫下與FITC（異硫氰酸熒光素）-共軛二級抗體（1∶250）常溫避光孵育。DAPI封片，并在400倍鏡下隨機選取5個視野采圖。用Image J軟件測定相對熒光強度，并取平均值。實驗重復3次后進行了統計分析。用激光掃描共焦顯微鏡對細胞內P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ蛋白表達位置以及熒光強度進行觀察。

1.7 ELISA法檢測細胞上清液中COLⅠ、COLⅣ的分泌情況

將細胞以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，待17 h細胞狀態穩定后，分組干預細胞48 h。48 h后收集各組細胞的上清液，在4℃下以1500×g離心20 min并按ELISA試劑盒說明書進行實驗，在450 nm波長處測定各孔的光密度（OD）值。

1.8 統計學方法

數據使用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較應用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GA對高糖誘導的MCs細胞活性的影響

本實驗采用CCK-8法檢測各組細胞的活性，與NG組（0.850±0.036）比較，HG組（1.47±0.130）細胞活性升高（P＜0.01）；與HG組比較，HG+GA組（0.966±0.086）細胞活性降低（P＜0.05）。

2.2 GA對高糖誘導的MCs細胞形態的影響

HE染色結果顯示，NG組MCs呈現梭形，膜完整性良好，細胞核形態規則。HG組細胞密度明顯增大，部分細胞體積顯著增加，細胞呈現長梭形，出現纖維化趨勢，表現出損傷特征。與HG組相比HG+GA組細胞形態有一定程度的改善，見圖1。

圖1 光學顯微鏡下觀察甘草酸對高糖作用下MCs形態學影響（HE×400）

2.3 GA對高糖誘導的MCs上清液中COLⅠ、COLⅣ分泌的影響

采用ELISA法檢測各組細胞COLⅠ、COLⅣ分泌情況。如表1所示，與NG組相比，HG組細胞分泌COLⅠ、COLⅣ表達均增高（P均＜0.01）。與HG組相比，HG+GA組細胞分泌COLⅠ、COLⅣ含量均下降（P均＜0.05）。

表1 GA對高糖誘導的腎小球系膜細胞ECM分泌的影響（n=3，±s，ng·mL-1）

表1 GA對高糖誘導的腎小球系膜細胞ECM分泌的影響（n=3，±s，ng·mL-1）

與NG組相比##P＜0.01；與HG組相比**P＜0.01。

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2.4 GA對高糖誘導的MCs內TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ蛋白表達的影響

采用Western blot法對各組細胞TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ的表達含量進行檢測。與NG組相比，HG組COLⅠ、COLⅣ表達均升高（P均＜0.01）。與HG組相比，HG+GA組COLⅠ、COLⅣ表達量均降低（P均＜0.01）。與NG組相比，HG組TGF-β1表達水平升高（P＜0.01），與HG組相比，HG+GA組TGF-β1表達水平降低（P＜0.05）。與NG組相比，HG組P-Smad2、PSmad3水平均升高（P均＜0.05）。與HG組相比，HG+GA組P-Smad2、P-Smad3水平均降低（P均＜0.05），見圖2。

2.5 GA對高糖誘導的MCs細胞P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ熒光強度的影響

與NG組相比，HG組細胞核內P-Smad3表達增高，熒光強度增強（P＜0.01），出現了明顯的核轉位現象。與HG組相比，HG+GA組細胞核內P-Smad3表達降低（P＜0.01），熒光強度減弱。COLⅠ、COLⅣ主要表達于細胞質中，與NG組相比，HG組細胞內COLⅠ、COLⅣ熒光強度均增高（P均＜0.01）；與HG組相比，HG+GA組COLⅠ、COLⅣ熒光強度均減弱，即COLⅠ、COLⅣ蛋白表達量下降（P均＜0.05），見圖3，與Western blot、ELISA檢測結果一致。

3 討論

目前對DN以降血糖藥物與血管緊張素轉換酶抑制劑為主要治療方案，但該療法成本高，副作用大，療程長[8]。所以探討DN的發病機制，尋找有效的天然早期抗糖尿病藥物已成為當下對于DN治療研究的重點。GA是三萜皂苷，是豆科灌木甘草（glycyrhiza glabra）植物根提取物的主要生物活性成分[9]。課題組前期研究發現[10]，GA可以有效延緩DN的進展，但其具體機制還有待于進一步研究。本研究發現GA可以有效抑制高糖誘導的系膜細胞的活性。組織病理學觀察，相比于正常組，高糖培養的腎小球系膜細胞出現排列紊亂，細胞形態偏細長，胞漿和細胞核變暗以及細胞密度增大等現象，而在GA干預后高糖誘導的細胞在形態上得到了有效的改善，表明GA可以對高糖誘導的系膜細胞起到保護作用。Western blot和ELISA方法檢測結果顯示，GA可有效抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞纖維化因子的表達，證實GA對高糖誘導的腎小球系膜細胞纖維化有明顯的抑制作用。

TGF-β1-Smads信號通路與多種纖維化疾病的發生及發展息息相關[11]，而且在DN的各個惡化進程中也起到關鍵性作用[12]。以往的研究發現，在DN患者的腎臟中TGF-β1因子的表達量增多，從而促進系膜基質外基質的合成并抑制其降解，導致腎小球的纖維化[13]。研究表明[14]，Smads蛋白是TGF-β1的直接下游因子，介導TGF-β1誘導的纖維化過程。TGF-β1通過與其受體的結合會導致Smad2和Smad3蛋白的磷酸化，該磷酸化后的蛋白會與Smad4結合形成低聚復合物，然后進入細胞核發揮轉錄作用，激活ECM的啟動因子[15]。因此，抑制TGF-β1因子以及P-Smad2和P-Smad3蛋白的表達量對調節ECM的表達有重要意義。本研究結果發現，GA高糖共培養組的腎小球系膜細胞TGF-β1和P-Smad2、3表達較高糖組降低，提示GA抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞ECM的產生，延緩DN腎纖維化進程的作用機制可能與調控TGF-β1-Smads信號通路密切相關。

圖2 Western blot檢測MCs細胞TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ蛋白的表達情況

綜上，GA抑制高糖誘導的腎小球系膜ECM的合成與TGF-β1-Smads信號通路有關，本實驗結果可以為GA藥物在DN治療領域的應用提供技術支持，但其具體的作用機制還有待于進一步的研究。

圖3 免疫熒光檢測MCs中P-Smad3、COLⅠ、COLⅣ表達情況