枸杞多糖對四氯化碳致急性肝損傷小鼠的保護作用

伍智慧，冉喆，張睛睛，王玉軍，侯紹章

（1.寧夏醫科大學基礎醫學院病理學系，銀川 750004；2.寧夏糖尿病及其并發癥基礎和臨床研究創新團隊，銀川 750004）

肝臟是人體合成代謝的重要器官，在調節消化排泄、營養物質儲存、代謝平衡、解毒等生理功能方面發揮著重要作用。由于個體差異性和基礎狀況的復雜性，人們在進行各種藥物對癥治療的同時，各種藥物所引起的不良反應未能引起重視，結果導致各臟器功能障礙也隨之逐漸出現[1-3]。藥物本身和（或）代謝產物引起的肝臟損害，是臨床上多見且嚴重的藥物不良反應，因此采取有效措施預防和治療肝損害已成為亟待解決的問題。研究顯示，肝臟疾病治療過程中多糖類化合物對其具有一定的保護作用[4-6]。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）是枸杞子的主要有效成分，由阿拉伯多糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖共同組成的一類大分子水溶性多糖，研究顯示其具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、調節免疫力等多種生理作用[7]。Keich樣環氧氯丙烷相關蛋白（Keich-like ECH-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相關蛋白（necular factor erythroid 2-related factor，Nrf2）在維持細胞氧化應激狀態中扮演著重要角色[8]。胃癌組織中Keap1、IKKβ表達異常，提示Keap1可能通過IKKβ對NF-kB信號通路的影響在胃癌的發生、發展、浸潤、轉移過程中具有一定作用[9]。IKKβ/NF-kB信號通路被稱之為經典的炎性反應信號通路，參與各類疾病的炎癥反應，但Keap1和IKKβ/NF-kB兩者在急性肝損傷的發生發展過程中是否存在關聯目前未見報道。因此本研究采用四氯化碳（CCl4）一次性腹腔注射誘導小鼠急性肝損傷，治療組給予不同劑量的枸杞多糖溶液進行干預，探討枸杞多糖對急性肝損傷是否具有保護作用，其保護作用是否與Keap1/IKKβ/NF-kB抗炎信號通路有關，以便為急性肝損傷的治療方案中藥物的使用提供一定的理論基礎和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

LBP（純度90%，寧夏啟元藥業有限公司），由寧夏醫科大學李光華老師課題組惠贈。CCl4（純度≥99.0%，上海麥克林生物科技有限公司）。AST、ALT、TNF-α、IL-1β和IL-6檢測試劑盒（上海江萊實業股份有限公司）。兔抗Keap1、IKKβ和NF-kB單克隆抗體（Cell Signaling Technology公司），鼠抗GAPDH單抗（Abways Technology公司），BCA蛋白含量檢測試劑盒和SDSPAGE凝膠試劑盒（南京凱基生物技術公司）。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑（Takara）（武漢塞維爾有限科技公司），引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PVDF膜（0.45μm）（Thermo Fisher Scientific公司）。酶標儀（美國Thermo Electron公司），低溫高速離心機（美國Thermo Electron公司），化學發光成像分析儀（美國GE公司），顯微鏡（日本OLYMPUS公司），石蠟切片機（美國Thermo Electron公司），垂直電泳儀，轉印儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性肝損傷模型制備 ICR小鼠40只，體質量28～32 g，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供［SCXK（寧）2015-0001］。所有小鼠飼養于溫度（22±2）℃、相對濕度（55±15）%的清潔級動物實驗中心，每日光照-黑暗周期12 h∶12 h。實驗前所有小鼠在動物實驗中心飼養1周，以適應實驗環境。適應性飼養1周后隨機分為5組，每組8只：正常對照組、模型組、LBP低劑量組（100 mg·kg-1）、LBP中劑量組（200 mg·kg-1）和LBP高劑量組（400 mg·kg-1）。LBP用生理鹽水溶解為對應藥物濃度，各組小鼠灌胃給藥0.5 mL各對應濃度的LBP溶液，正常對照組和模型組灌胃等劑量生理鹽水0.5 mL，每天1次，持續7 d。末次給藥后1 h，除正常對照組小鼠腹腔注射等劑量花生油外，其余各組小鼠一次性腹腔注射CCl4食用花生油溶液（濃度為0.1%，10 mg·kg-1）誘導小鼠急性肝損傷。造模16 h時所有小鼠禁飲禁食，24 h時先摘取眼球采血制備血清，然后頸椎脫臼致死后取肝臟組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，稱重后一半作常規固定包埋，制成蠟塊備用，另一半-80℃保存備用。

1.2.2 小鼠肝臟指數變化 造模后24 h眼球取血，取血前稱取小鼠體質量，取血后小鼠頸椎脫臼致死取肝臟并稱重以計算肝臟指數。肝臟指數=肝臟重量（g）/小鼠體質量（g）×100%。

1.2.3 小鼠肝組織病理學觀察 取各組小鼠相同部位肝臟組織，置于4%多聚甲醛浸泡固定24 h，脫水透明，石蠟包埋，切片。蘇木素-伊紅（HE）染色，200倍光鏡下觀察肝臟組織病理學變化。

1.2.4 小鼠血清肝功能指標及炎癥因子檢測 眼球取血室溫凝固1～2 h，4℃冰箱過夜，待自然血清析出后，低溫高速（4℃，15000 r·min-1）離心10 min，分離至備用干凈離心管中。按照ELISA檢測試劑盒說明書在室溫下操作，檢測肝功能指標谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）及炎性指標腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）和白細胞介素6（IL-6）表達水平。

1.2.5 qRT-PCR法檢測小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB的mRNA表達 取100 mg肝臟組織加入勻漿管中，嚴格按照試劑盒說明采用Trizol方法從肝臟組織中提取Keap1、IKKβ、NF-kB全RNA經反轉錄合成cDNA。以GAPDH為內參，引物序列見表1。PCR反應條件：94℃10 min，94℃30 s，56℃40 s，72℃40 s，循環40次，收集數據進行熔解曲線分析。反應結束后以2-ΔΔCT方法計算目的基因相對內參GAPDH的相對表達水平，重復該實驗3次。

1.2.6 Western blot檢測小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB蛋白的表達 從-80℃冰箱取出凍存肝臟組織，取各組小鼠相同部位組織約100 mg，剪成小塊，加入蛋白裂解液1 mL，冰上混勻研磨10 min/次，重復3次。裂解后組織勻漿低溫高速（4℃，15000 r·min-1）離心10 min，取上清于備用干凈離心管置于-80℃冰箱保存備用。采用BCA蛋白定量法定量蛋白并分裝（40μg·μL-1），100℃使蛋白變性，保存-80℃冰箱。配制10%分離膠，灌入分離膠至2/3位置處，用水封膠，室溫靜置10 min后倒掉水，用濾紙吸干殘留水分后加入濃縮膠插入1.0梳子，室溫靜置30 min后拔掉梳子蛋白上樣10μL/30μg。電泳穩壓100 V，待溴酚藍至分離膠底端時停止電泳；轉模280 mA，100 min。轉模結束，用1×TBST洗膜液洗膜5 min/次，重復3次；5%脫脂牛奶室溫搖床封閉2 h后用1×TBST洗膜液洗膜5 min/次，重復3次；加一抗Keap1、IKKβ、NF-kB于抗體孵育盒4℃過夜，次日取出室溫復溫1 h，回收一抗，TBST洗膜液洗膜3次，每次5 min；加二抗，在室溫搖床1 h后再用1×TBST洗膜液洗膜3次，每次5 min，然后進行化學發光成像曝光條帶。采用Image J軟件進行分析計算灰度值（靶蛋白灰度值/GAPDH灰度值）。

表1 Keap1、IKKβ、NF-kB的引物

1.3 統計學方法

實驗數據采用SPSS 23.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝濕重、體質量和肝臟指數的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠肝濕重增加、體質量下降、肝臟指數升高（P＜0.05或＜0.01）。與模型組相比，LBP低劑量組和中劑量組肝濕重、體質量和肝臟指數差異均無統計學意義（P均＞0.05），高劑量組肝濕重下降、體質量增加、肝指數下降（P＜0.05或＜0.01），見表2。

2.2 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織病理學變化的影響

正常對照組肝組織肝小葉結構完整清晰，肝細胞形態正常，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列。模型組肝小葉和肝細胞結構紊亂不規則，有不同程度性水腫，呈空泡樣變性，部分有炎細胞浸潤。與模型組相比，LBP低劑量組、中劑量組和高劑量組有不同程度減輕，并隨藥物劑量的增加改善程度愈加明顯，細胞排列趨于正常，細胞水腫逐漸減輕，空泡樣改變逐漸消失，炎細胞浸潤逐漸減少，見圖1。

表2 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝濕重、體質量和肝臟指數的影響

圖1 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織病理形態的影響（HE×200）

2.3 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠血清生化指標和炎性因子水平的影響

與正常對照組相比，模型組ALT、AST、TNFα、IL-1β、IL-6水平均升高（P均＜0.01）。與模型組相比，LBP低劑量組IL-1β水平降低（P＜0.01），其余指標差異均無統計學意義（P均＞0.05）；LBP中劑量組僅ALT水平無明顯變化，AST、TNF-α、IL-1β、IL-6均降低（P均＜0.01）；高劑量組AST、ALT、TNF-α、IL-1β、IL-6均降低（P均＜0.01），見圖2。

2.4 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB mRNA表達的影響

與對照組相比，模型組Keap1mRNA的表達降低（P＜0.01），而IKKβ和NF-kBmRNA表達均升高（P均＜0.01）。與模型組相比，低劑量組Keap1、IKKβ和NF-kBmRNA表達差異均無統計學意義（P均＞0.05）；中劑量組和高劑量組Keap1mRNA表達均升高（P均＜0.01），而IKKβ和NF-kBmRNA的表達均降低（P均＜0.01），見圖3。

2.5 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB蛋白表達的影響

與正常對照組相比，模型組Keap1蛋白表達降低（P＜0.01），IKKβ蛋白表達升高（P＜0.01），NF-kB蛋白表達升高（P＜0.05）。與模型組相比，高劑量組Keap1蛋白表達升高（P＜0.05）；LBP中劑量組和高劑量組IKKβ和NF-kB蛋白表達降低（P＜0.01），見圖4。

3 討論

圖2 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST、TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平的影響

圖3 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB mRNA表達的影響

圖4 LBP對CCl4致急性肝損傷小鼠肝組織Keap1、IKKβ、NF-kB蛋白表達的影響

肝臟損傷的動物模型復制途徑包括化學性、免疫性、生物性、酒精性等方法。CCl4長期以來由于其誘導的動物模型所表現的癥狀、肝功能檢查指標以及病理學變化與人體肝損傷十分相似而被廣泛使用。該方法操作簡單，重復性好而被認為是經典的肝損傷模型，常用來進行保肝藥物的篩選。由于肝臟屬于再生組織，具有強大的組織修復能力，因此造模過程中給藥劑量和用藥時間不同可引起急性肝損傷、慢性肝損傷和肝纖維化等不同實驗所需要的動物模型[10]。本實驗遂采取CCl4食用花生油溶液（濃度為0.1%）0.1 mL/10 g一次性腹腔注射誘導小鼠急性肝損傷。血清生化指標ALT和AST是存在于胞漿內的兩種可溶性酶，是判斷肝功能受損的重要指標。肝細胞經CCl4損傷時，細胞膜通透性增強，ALT和AST由胞質釋放到胞外，血清含量升高，在一定程度上反映了肝臟損傷的嚴重程度。

目前，急性肝損傷的發病機制主要與氧化應激和炎癥反應有著密切關系。LBP是從我國傳統名貴藥材枸杞中提取的主要有效成分，保肝作用是LBP目前研究比較廣泛的一面，主要是通過降低肝臟受損狀態下氧化應激水平來實現的[11]。急性肝損傷時，肝臟會產生一系列的免疫應答反應，作為機體最大的巨噬細胞庫，又稱肝庫普弗細胞（Kupffer細胞）分泌大量的炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等參與肝損傷的發生過程。TNF-a是肝巨噬細胞受損時釋放最早的炎性細胞因子；IL-1β作為體內最強的炎性因子，是TNF-α級聯反應的產物，又是免疫炎癥反應的重要介質，促進炎癥細胞因子的表達，誘導細胞免疫應答；IL-6是重要的淋巴因子，通過激活調節免疫細胞，參與免疫反應，當它們過度表達時介導炎性因子趨化作用加劇瀑布樣炎癥反應，最終導致組織損傷[12]。核因子-kB（nuclear factor-kB，NF-kB）是免疫炎癥反應過程中經典的炎性因子，靜息狀態NF-kB與其抑制因子（inhibitor of nuclear factors-kB，Ikβ）相結合形成復合物，使NFkB滯留在細胞質中處于非活化狀態呈現低表達水平。核轉錄因子-kβ抑制蛋白激酶（inhibitor of nuclear factors-kB kinase，IKK）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合體，由IKKα、IKKβ、IKKγ3個亞基組成，其中IKKβ具有絲氨酸蛋白激酶活性，是NF-kB上游重要的調節激酶[13]。肝細胞經CCl4損傷時，白細胞介素作為一種重要的炎性介質和免疫調節因子，使IKK被激活，IkB蛋白降解，NFkB與IkB解離，NF-kB隨即由胞質轉位至胞核內與特異性啟動子結合，介導炎性細胞因子在細胞內與細胞之間相互表達，多向調節炎癥反應，引起炎癥反應的級聯放大效應[14-15]。

Keap1又稱胞漿肌動蛋白伴侶分子，通過泛素連接酶E3與靶蛋白特異性結合促使靶蛋白泛素化降解，Nrf2是細胞抗氧化應激的轉錄因子，在胞質中與Keap1結合，被Keap1負性調控[8]。相關研究表明IKKβ與Keap1相互作用類似于Nrf2，可以直接作用于IKKβ，調控NF-kB信號通路[16-17]。本研究結果顯示，與對照組相比，小鼠經CCl4誘導的模型組ALT和AST活性升高，Keap1表達降低，IKKβ、NF-kB、TNF-α、IL-1β、IL-6表達升高；與模型組相比，LBP低劑量對模型組的損傷基本無明顯改善，中劑量組和高劑量組ALT和AST活性降低，Keap1表達升高，IKKβ、NFkB、TNF-α、IL-1β、IL-6表達降低。

綜上所述，LBP可有效改善CCl4致小鼠急性肝損傷的損傷程度，降低炎性因子的表達，對CCl4致急性肝損傷小鼠具有保護作用，其保護作用可能與增強Keap1活性，降低IKKβ/NF-kB信號通路活性有關。