β-谷甾醇通過P I3K/A KT通路影響顆粒細胞增殖及凋亡

趙 帥，陳冬梅，2，虎 娜，楊張杰，王宇欣，馬會明

（1.寧夏醫科大學生育力保持教育部重點實驗室，銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院干細胞研究所，銀川 750004）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期女性最為常見的內分泌紊亂和代謝異常性疾病之一，育齡婦女發病率6%～21%，是女性不孕的主要原因之一[1]。PCOS中顆粒細胞增殖和凋亡異常以及顆粒細胞與卵母細胞間的縫隙連接或旁分泌通訊功能受限，都會導致PCOS卵泡發育障礙，并影響排卵和黃體生成。有文獻報道[2]，卵巢顆粒細胞增殖和凋亡在促進卵泡發育功能、卵母細胞的成熟以及合成和分泌卵泡抑制素（follicle stimulating hormone，FSH）、雌激素和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）等方面均具有重要作用。因此，增強卵巢顆粒細胞的增殖能力、降低凋亡率的作用可改善卵母細胞生長和成熟的微環境，同時也為卵母細胞的生長、發育、募集以及排卵過程提供營養物質，進而改善PCOS的卵巢功能。

β-谷甾醇（β-sitosterol）是一種天然多酚羥酸類化合物，屬于甾醇類成分中的主要成分之一，β-谷甾醇通過多靶點、多途徑發揮抗氧化、抗炎、抗凋亡和神經保護等生物學活性[3]。β-谷甾醇可通過增加癌細胞凋亡來抑制肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌，在人白血病細胞中表現出顯著的抗誘導凋亡活性的作用[4-7]。β-谷甾醇可下調ERK1/2和上調Bcl-2/Bax抑制心肌細胞凋亡[8]。有研究發現[9]，PI3K/AKT/GSK3通路在PCOS發病機制中發揮重要作用。IGF1R/PI3K信號通路主要在卵巢顆粒細胞中發揮作用[10]。目前，有關PCOS排卵障礙中卵泡發育延遲和排除受阻的發病機制與顆粒細胞增殖、凋亡和分泌密切相關。因此，需要通過解決顆粒細胞增殖緩慢和凋亡增加的問題，以改善PCOS卵巢排卵障礙的狀態。然而，β-谷甾醇抗凋亡、促增殖的特點是否對顆粒細胞具有具體作用也尚未有文獻報道。本研究擬通過檢測β-谷甾醇對卵巢顆粒細胞的增殖與凋亡及其對PI3K/AKT信號通路相關表達的影響，為PCOS卵泡發育障礙的機制研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要細胞株 人卵巢顆粒細胞系（KGN）由寧夏醫科大學生育力保持教育部重點實驗室保存。

1.1.2 主要藥物和試劑 β-谷甾醇（MCE公司），P-PI3KCA抗體（Affinity公司），PI3K（Abcam公司），AKT、P-AKT抗體、Caspase-3、GAPDH抗體（博奧森公司），Annexin V-FITC碘化丙啶（PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒（BD）公司，DAPI染色液、免疫熒光抗兔CY3和FITC二抗（Thermo Fisher公司）、HRP標記二抗（博奧森公司）、CCK-8細胞增殖、細胞周期檢測試劑盒、PI染色液、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒、ECL發光液（凱基生物公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 用含10%胎牛血清+1%青鏈霉素的DMEM培養液于37℃、5%CO2的恒溫細胞培養箱中培養KGN。

1.2.2 實驗分組及試劑配制 分為對照組和β-谷甾醇處理組；β-谷甾醇處理組：10、20、40和80μmol·L-1的β-谷甾醇處理KGN細胞。對照組：無藥物處理的細胞，DMEM培養液中培養。1 g的β-谷甾醇粉末溶解于0.5 mL DMSO+29.64 mL DMEM培養液中配制成80 mmol·L-1母液，使用時參照說明書稀釋成80μmol·L-1工作濃度。

1.2.3 CCK-8檢測不同濃度β-谷甾醇對KGN細胞增殖的影響 收集對數生長期KGN細胞，每孔1×104個細胞，均勻接種于96孔培養板內，37℃培養箱培養24 h，β-谷甾醇處理組分別設置10、20、40和80μmol·L-1濃度梯度，對照組為0μmol·L-1，每個濃度設置6個復孔，培養24 h后，然后每孔分別加入10μL CCK-8溶液，培養箱再培養4 h后，用酶標儀在450 nm波長處檢測其光密度（OD）值，確定細胞增殖情況。

1.2.4 CCK-8檢測β-谷甾醇作用不同時間對KGN細胞增殖的影響 收集對數生長期KGN細胞，均勻接種于96孔板，添加20μmol·L-1的β-谷甾醇處理細胞，分別培養0、12、24、36和48 h，每個時間點6個復孔，在不同的時間點加10μL CCK-8，培養4 h檢測OD值，確定細胞增殖情況。

1.2.5 流式細胞術檢測β-谷甾醇對KGN細胞凋亡的影響 20μmol·L-1的β-谷甾醇處理24 h后，用不含EDTA胰酶消化對照組和β-谷甾醇處理組，收集5×105個細胞。PBS洗滌2次，每管加入500μL 1×Binding Buffer 500μL重懸細胞，每管加入5μL Annexin V-FITC混勻后，室溫避光孵育15 min，再向每管加入5μL Propidium Iodide（PI）混勻，室溫避光孵育5 min，用流式細胞儀上機。實驗重復4次取均值計算細胞凋亡率。凋亡率=凋亡細胞數/（凋亡細胞數+正常細胞數）×100%。

1.2.6 流式細胞術測定β-谷甾醇對KGN細胞周期的影響 對數生長期1×104個/mL KGN細胞接種于6孔板中，培養24 h后加入20μmol·L-1的β-谷甾醇處理24 h，同時設對照組，消化離心收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，細胞懸液低速渦旋振蕩同時加入70%乙醇后，4℃固定細胞過夜。次日離心沉淀細胞，預冷PBS清洗離心，重懸細胞，每個樣品加入400μL PI染色液，37℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測，再用Modifit軟件分析顆粒細胞在不同周期中的比例。

1.2.7 細胞免疫熒光法檢測KGN細胞內PPI3KCA、P-AKT和Caspase-3蛋白定位和分布 將KGN細胞固定、漂洗、TritonX-100透化、封閉，滴加P-PI3KCA（1∶100）、P-AKT（1∶200）和Caspase-3抗體（1∶100）一抗，濕盒4℃孵育過夜，陰性對照用PBS代替一抗。PBS洗3次，每次5 min；加CY3和FITC標記的羊抗兔IgG（1∶200）熒光二抗25℃避光孵育1 h。PBS洗5次，每次5 min，DAPI染核，PBS洗滌，抗熒光淬滅劑封固，熒光顯微鏡下觀察細胞內P-PI3KCA、P-AKT和Caspase-3蛋白的定位和分布，并避光拍照。

1.2.8 Western blot技術檢測KGN細胞PPI3KCA、P-AKT、Caspase-3蛋白的表達 對照組和β-谷甾醇組KGN細胞加入預冷的裂解液，于冰浴中反復用1 mL移液器吹打裂解。BCA測定蛋白濃度，將蛋白調整至統一濃度后，加入5×上樣緩沖液，沸水浴10 min蛋白變性后電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%BSA封閉2 h，TBST洗膜后加入GAPDH抗體（1∶1000稀釋）、AKT（1∶300）、PI3K（1∶400）、P-PI3KCA抗體（1∶300稀釋）、PAKT抗體（1∶500稀釋）和Caspase-3抗體（1∶400稀釋），4℃過夜。次日，TBST洗膜，加入HRP山羊抗兔IgG（1∶20000稀釋），室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL發光液曝光并拍照。運用Image Lab圖像分析軟件測定條帶灰度值，并計算PPI3KCA/PI3K、P-AKT/AKT和Caspase-3蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度β-谷甾醇對KGN細胞增殖的影響

結果顯示，與對照組（0μmol·L-1）比較，添加20μmol·L-1β-谷甾醇促進KGN細胞增殖的作用最強（P＜0.01），當β-谷甾醇濃度增至40、80μmol·L-1時，β-谷甾醇處理組細胞增殖能力與對照組間相比差異均無統計學意義（P均＞0.05），因此，根據藥理學Fisher原則中最低有效濃度與最低中毒濃度的原則，選擇20μmol·L-1β-谷甾醇培養KGN細胞進行后續實驗，見圖1。

圖1 CCK-8法檢測不同濃度β-谷甾醇對KGN細胞增殖的影響

2.2 β-谷甾醇作用不同時間對KGN細胞增殖的影響

CCK-8檢測結果顯示，添加20μmol·L-1β-谷甾醇的KGN細胞培養不同時間，培養0、12、36、48與24 h相比KGN細胞分裂增殖降低（P＜0.01），故選擇添加20μmol·L-1β-谷甾醇培養KGN細胞24 h，進行后續實驗，見圖2。

圖2 β-谷甾醇作用不同時間對KGN細胞增殖的影響

2.3 β-谷甾醇對顆粒細胞凋亡的影響

流式細胞檢測結果顯示，20μmol·L-1β-谷甾醇處理組培養24 h，KGN細胞總凋亡率降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 β-谷甾醇對KGN細胞周期的影響

細胞周期實驗結果顯示：與對照組相比，20μmol·L-1β-谷甾醇作用24 h能增加S+G2/M期細胞所占比例，減少G0/G1期細胞所占比例（P均＜0.05），見表1。

圖3 流式細胞儀檢測β-谷甾醇對KGN細胞凋亡的影響

表1 β-谷甾醇對KGN細胞周期分布的影響（±s，%）

表1 β-谷甾醇對KGN細胞周期分布的影響（±s，%）

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2.5 細胞免疫熒光檢測KGN細胞內P-PI3KCA、P-AKT、Caspase-3蛋白表達定位

熒光顯微鏡下觀察顯示，綠色熒光定位于胞核和胞質，即P-PI3KCA、P-AKT、Caspase-3在顆粒細胞胞核和胞質表達，見圖4。

2.6 Western blot檢測β-谷甾醇對KGN細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

Western blot檢測KGN細胞內P-PI3KCA、P-AKT和凋亡家族中Caspase-3蛋白表達，結果顯示，與對照組比較，β-谷甾醇處理組P-PI3KCA蛋白和P-AKT蛋白表達上調，Caspase-3蛋白表達下調（P均＜0.05），見圖5。

3 討論

圖4 細胞免疫熒光檢測P-PI3KCA、P-AKT和Caspase-3在KGN細胞中的表達定位（×200）

圖5 Western blot檢測β-谷甾醇對KGN細胞Caspase-3、P-PI3KCA/PI3K、P-AKT/AKT蛋白表達的影響

PCOS的高發病率嚴重影響女性生活質量，其臨床表型多為雄激素過多、排卵障礙和卵巢多囊腔樣改變，PCOS顆粒細胞數量的減少以及顆粒細胞增殖受抑制會直接影響PCOS女性排卵，導致不孕。因此，顆粒細胞作為PCOS卵巢卵泡發育的重要功能細胞，其增殖和凋亡會影響雌孕激素的產生，同時也會影響卵母細胞的發育、成熟以及微環境的穩態[11]。本研究中CCK-8結果顯示，20μmol·L-1的β-谷甾醇促進顆粒細胞的增殖，在培養24 h時顆粒細胞的增殖能力更加明顯。流式細胞結果顯示，細胞增殖加快，細胞新陳代謝增加，死亡細胞數相對較多。細胞增殖的促進或抑制是通過調節細胞周期各階段的DNA含量來實現的，本實驗中流式細胞儀測定顆粒細胞DNA含量的結果表明，與對照組相比，β-谷甾醇處理組顆粒細胞的G0/G1期細胞所占比例減少，S+G2/M期細胞所占比例增加，證實β-谷甾醇發揮促顆粒細胞增殖作用。

PI3K/AKT信號通路是調控細胞增殖、凋亡及細胞周期的重要信號通路[12]，通過激活PI3K/AKT信號通路能上調細胞增殖能力，抑制細胞凋亡。PI3K（Phosphatidylinositol 3-kinase）作為PI3K/AKT/mTOR信號通路的直接上游關鍵分子，其亞基PIK3CA導致p110α酶活性的激活，從而刺激了不依賴生長因子的細胞生長[12]。AKT是PI3K的關鍵下游效應分子，P-AKT作為AKT的活化形式，能磷酸化許多與細胞凋亡密切相關的組件實現細胞存活[13]。而且PI3K激活能有效上調AKT的磷酸化水平，從而激活mTOR調控細胞生物過程，實現細胞存活，在顆粒細胞的增殖、卵泡的發育、閉鎖和黃體過程中也扮演著重要的角色[14]。本文采用β-谷甾醇處理顆粒細胞，結果提示，與對照組相比較，β-谷甾醇干預顆粒細胞后P-AKT和P-PI3KCA表達上調，β-谷甾醇組促進顆粒細胞增殖。細胞凋亡的凋亡啟動階段，細胞會存在膜受體途徑、細胞色素C釋放和Caspases激活等途徑[15]。Caspase-3是位于哺乳動物細胞凋亡通路下游關鍵的死亡蛋白酶，最重要的凋亡蛋白酶，其表達量直接反映細胞凋亡程度[16]。結果顯示，與對照組相比較，β-谷甾醇處理顆粒細胞后Caspase-3表達下調，提示β-谷甾醇抑制顆粒細胞凋亡。Annexin V FITC/PI檢測結果顯示，與對照組相比，在加入β-谷甾醇處理顆粒細胞24后（即細胞培養48 h時），β-谷甾醇可降低顆粒細胞凋亡率，該結果與已有的報道[17-18]結論一致。

綜上所述，20μmol·L-1的β-谷甾醇可通過增加P-AKT和P-PIK3CA蛋白表達水平促進顆粒細胞增殖，且降低Caspase-3蛋白表達水平，從而抑制顆粒細胞凋亡。這為PCOS在PI3K/AKT/mTOR的信號通路及作用效果的研究提供了一定的依據。