脂肪乳劑對急性布比卡因中毒S D大鼠海馬齒狀回星形膠質細胞活化的影響

代紫娟，吳 芳，擺志霞，王晨曦，陳學新

（1.寧夏醫科大學，銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院腫瘤醫院麻醉科，銀川 750004）

布比卡因（bupivacaine，BPV）是常見的酰胺類局部麻醉藥，因其良好的鎮痛效果而在臨床麻醉和疼痛治療中廣泛使用[1]，但其藥物毒性也會作用于心血管和中樞神經系統（central nervous system，CNS）引起局麻藥全身毒性急性反應（local anesthetic acute systemic toxicity，LAST）。在局麻藥引起的LAST中，通常引發CNS毒性的藥物劑量會低于引起心血管毒性癥狀的劑量[2]，且BPV的藥物毒性更容易作用于CNS[3]。在2017年發布的第三屆美國區域麻醉與疼痛醫學學會關于局部麻醉系統毒性的救治指南中，專家建議應在使用局部麻醉藥后出現長時間驚厥發作、心律失常的第一時間使用脂肪乳劑（lipid emulsion，LE）治療[4]，但其具體作用機制尚不清楚。本研究通過建立SD大鼠急性BPV神經毒性模型，研究使用LE救治急性布比卡因中毒SD大鼠后，觀察對其海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）星形膠質細胞活化的影響，進而探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠50只，體質量（220±20）g，購自寧夏醫科大學實驗動物中心［SCXK（寧）2015-0001］。SD大鼠飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心SPF級動物房［SCXK（寧）2015-0001］，自由采食和飲水，室內溫度20～25℃，濕度40%～70%，12 h亮暗循環。動物實驗經寧夏醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 試劑與儀器 鹽酸布比卡因注射液（上海朝暉藥業有限公司）；20%脂肪乳注射液（四川科倫藥業股份有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（四川科倫藥業股份有限公司）；抗腦源性神經營養因子（BDNF）抗體、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、巢蛋白（Nestin）抗體（Proteintech中國公司）；辣根酶標記兔抗山羊IgG、辣根酶標記鼠抗山羊IgG、兔/鼠二步法檢測試劑盒、DAB顯色液試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液、山羊血清、檸檬酸鹽修復液（北京中杉金橋生物技術有限公司）；全自動石蠟切片機、光學顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及實驗分組 SD大鼠電子稱稱重后，按1.5 mg·（kg·min）-1的速度，計算出每只SD大鼠BPV的輸注速度，調制好微量泵數值。選大鼠尾部兩側靜脈，75%酒精反復擦拭消毒后使用24號留置針穿刺置管并固定，連接微量泵持續將0.75%BPV經尾靜脈泵入，直至SD大鼠四肢及肢體出現抽搐。依照Racine分級法[5]進行抽搐分級（0級：無反應；Ⅰ級：嘴或面部節律性抽動；Ⅱ級：點頭或甩尾；Ⅲ級：單肢抽動；Ⅳ級：多只抽動或強直；Ⅴ級：不能翻正、直至全身強直-陣攣性發作）。納入標準：SD大鼠抽搐分級達到V級。排除標準：SD大鼠未達到V級或者死亡。

采用隨機數字表法將50只SD大鼠隨機分為五組（每組10只）：對照組（Control組）經尾靜脈以3 mL·（kg·min）-1的速率輸注0.9%氯化鈉注射液（NS）5 min；脂肪乳劑組（LE組）經尾靜脈以3 mL·（kg·min）-1的速率輸注20%脂肪乳5 min；布比卡因組（BPV+NS組）經尾靜脈以1.5 mL·（kg·min）-1的速率輸注0.75%BPV至大鼠驚厥發作后以3 mL·（kg·min）-1的速率輸注0.9%NS 5 min；脂肪乳劑后處理組（BPV+LE組）經尾靜脈以1.5 mg·（kg·min）-1的速率輸注0.75%BPV至大鼠驚厥發作后以3 mL·（kg·min）-1的速率輸注20%脂肪乳5 min；脂肪乳劑預處理組（LE+BPV+LE組）先經尾靜脈以3 mL·（kg·min）-1的速率輸注20%脂肪乳5 min，后以1.5 mg·（kg·min）-1的速率輸注0.75%BPV至大鼠驚厥發作，再以3 mL·（kg·min）-1的速率輸注20%脂肪乳5 min。

1.2.2 樣品采集與處理 各組SD大鼠給藥完成6 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉35 mg·kg-1進行麻醉，開胸暴露心臟，經心臟先后灌注NS和4%多聚甲醛溶液，待肝臟發白、全身僵硬后小心取出完整腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后石蠟包埋。用振動顯微切片機將包埋好的組織行冠狀切片，厚度4μm，切至海馬層面，在65℃的烤箱中烘烤2 h后常規脫蠟脫水后進行HE染色和免疫組織化學法檢測。

1.2.3 HE染色觀察SD大鼠海馬齒狀回區神經細胞形態改變 石蠟切片經二甲苯、梯度酒精脫蠟入水后，經蘇木素染色3 min，超純水沖洗，1%鹽酸乙醇中分化3 s，自來水返藍10 min，伊紅染色2 min后酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察SD大鼠海馬組織中神經細胞數量、形態變化。將每張切片置于400倍顯微鏡下觀察異常細胞，對正常細胞核變性、壞死細胞進行量化評分。組織病理評分標準[6]分為0～4分，0分:無損傷；1分:損傷程度＜12.5%；2分:損傷程度在12.5%～25%；3分:損傷程度在25%～50%；4分:損傷程度＞50%。

1.2.4 免疫組織化學（IHC）染色觀察GFAP、BDNF和Nestin在SD大鼠海馬齒狀回（DG）區的陽性表達 將石蠟切片經二甲苯和梯度酒精脫蠟入水后，參照兔/鼠二步法檢測試劑盒說明書滴加試劑，分別滴加一抗（BDNF、GFAP、Nestin）后，4℃冰箱孵育過夜，次日漂洗后滴加山羊抗兔、鼠IgG聚合物室溫孵育30 min，漂洗后DAB顯色，蘇木素復染5 min，1%鹽酸乙醇分化，自來水返藍，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察BDNF、GFAP、Nestin蛋白在SD大鼠海馬齒狀回區的陽性表達。每個樣本取3張清晰切片，在400倍鏡下選取3個視野拍攝圖像，通過Image Pro Plus圖像處理軟件進行陽性染色細胞計數，統計分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析。正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。病理評分采用Kruskal-Wallis檢驗，采用Dunnett-t檢驗進行多重比較。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組SD大鼠急性BPV中毒及LE解救后的表現及BPV使用劑量的比較

結果顯示，各組SD大鼠體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。各組SD大鼠在輸注BPV的數分鐘后出現面部抽動、點頭、甩尾、四肢無力進而四肢僵直和驚厥，部分SD大鼠驚厥時伴有口鼻出血和大小便失禁等現象，與BPV+LE組比較，LE+BPV+LE組的SD大鼠從給藥到發生驚厥所需的輸注劑量更高，但兩組在發生驚厥后靜注LE均能有效緩解驚厥癥狀。如表1所示，LE+BPV+LE組SD大鼠所使用的BPV劑量高于BPV+LE組和BPV+NS組（P均＜0.01），BPV+NS組和BPV+LE組差異無統計學意義（P=0.797）。

表1五組SD大鼠體質量和致驚厥BPV使用劑量的比較（±s）

表1五組SD大鼠體質量和致驚厥BPV使用劑量的比較（±s）

與BPV+NS組比較**P＜0.01；與BPV+LE組比較##P＜0.01。

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2.2 各組SD大鼠海馬齒狀回神經細胞形態改變和病理評分比較

顯微鏡下觀察海馬齒狀回（圖1），結果顯示，Control組和LE組SD大鼠無明顯病理改變，神經細胞胞漿紫紅色，胞核紫藍色，排列整齊，核仁著色均勻。BPV+NS組神經細胞排列紊亂，可見受損細胞胞核發生位移、深染、固縮，有部分細胞出現空泡樣變性，著色淺，胞體皺縮。BPV+LE組和LE+BPV+LE組的神經細胞結構形態稍顯正常，有少量壞死細胞、空泡樣變性，細胞體積輕度皺縮。病理學評分統計，與Control組比較，BPV+NS組、BPV+LE組和LE+BPV+LE組SD大鼠評分均升高（P均＜0.01）；與LE組比較，BPV+NS組、BPV+LE組和LE+BPV+LE組SD大鼠評分均升高（P均＜0.01）；與BPV+NS組 比 較，BPV+LE組評分降低（P=0.0224）、LE+BPV+LE組評分降低（P=0.0313）；BPV+LE組和LE+BPV+LE組、Control組和LE組間差異均無統計學意義（P均＞0.05），見表2、圖2。

表2 各組SD大鼠海馬HE染色病理評分比較（±s，分）

表2 各組SD大鼠海馬HE染色病理評分比較（±s，分）

與Control組比較**P＜0.01；與LE組比較##P＜0.01；與BPV+NS組比較△P＜0.05。

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圖1 正常SD大鼠海馬DG區

2.3 各組SD大鼠海馬齒狀回GFAP的陽性表達

GFAP在正常腦組織中有少量陽性表達，陽性產物為棕黃色，圍繞著細胞核沿著星形膠質細胞骨架呈放射狀、細長、樹枝樣突起。免疫組化結果顯示，Control組SD大鼠海馬DG區的GFAP蛋白陽性表達稍低，與Control組比較，BPV+NS組、BPV+LE組和LE+BPV+LE組SD大鼠的膠質細胞數目增加，突起變得粗短，著色加深，GFAP蛋白陽性表達均升高（P均＜0.01）；與LE組比較，BPV+NS組、BPV+LE組和LE+BPV+LE組SD大鼠GFAP蛋白陽性表達均升高（P均＜0.01）；與BPV+NS組比較，BPV+LE組和LE+BPV+LE組SD大鼠GFAP蛋白陽性表達均有一定程度降低（P均＜0.01）；BPV+LE組和LE+BPV+LE組、Control組和LE組之間差異均無統計學意義（P均＞0.05），見圖3。

2.4 五組SD大鼠海馬齒狀回BDNF的陽性表達

BDNF蛋白在正常的腦組織中有一定的陽性表達，免疫陽性產物為棕黃色，呈環狀包繞在細胞核周圍。免疫組化結果顯示，Control組的SD大鼠海馬DG區BDNF蛋白陽性表達較低，與Control組比較，BPV+NS組、BPV+LE組和LE+BPV+LE組SD大鼠BDNF蛋白陽性表達均升高（P均＜0.01）；LE組比較，BPV+NS組、BPV+LE組和LE+BPV+LE組SD大鼠BDNF蛋白陽性表達均升高（P均＜0.01）；與BPV+NS組比較，BPV+LE組和LE+BPV+LE組SD大鼠BDNF蛋白陽性表達均有一定程度降低（P均＜0.01）；與BPV+LE組和LE+BPV+LE組、Control組和LE組之間差異均無統計學意義（P均＞0.05），見圖4。

圖3 各組大鼠海馬DG區GFAP免疫組化結果（IHC×400）

圖4 各組大鼠海馬DG區BDNF免疫組化結果（IHC×400）

2.5 各組SD大鼠海馬齒狀回Nestin的陽性表達

正常成年SD大鼠腦組織中有極少量Nestin蛋白表達，免疫陽性產物為棕黃色，陽性著色部位在胞漿中，形狀不規則，在海馬及皮層呈顆粒狀。免疫組化結果顯示，Control組的大鼠海馬DG區Nestin蛋白陽性表達稍低，與Control組比較，BPV+NS組、BPV+LE組和LE+BPV+LE組大鼠Nestin蛋白陽性表達均升高（P均＜0.01）；與LE組比較，BPV+NS組、BPV+LE組和LE+BPV+LE組大鼠Nestin蛋白陽性表達均升高（P均＜0.01）；與BPV+NS組比較，BPV+LE組和LE+BPV+LE組大鼠Nestin蛋白陽性表達均有一定程度降低（P均＜0.01）；BPV+LE組和LE+BPV+LE組、Control組和LE組之間差異均無統計學意義（P均＞0.05），見圖5。

3 討論

以往研究[7]顯示，當BPV血藥濃度較低時會引起神經元離子通道的阻滯進而出現CNS毒性癥狀，表現為聽力和味覺障礙、頭暈以及惡心嘔吐，驚厥或持續癲癇；當BPV血藥濃度繼續增大時會出現心血管系統毒性反應，例如心跳驟停；給藥速度越快，毒性反應越容易發生，導致驚厥的劑量也減少。本實驗采用SD大鼠尾靜脈注射方法，使用微量注射泵輸注BPV，在造成SD大鼠急性BPV中毒發生驚厥的同時又不易導致大鼠死亡。通過記錄造模所需BPV的劑量，本研究發現LE預處理后，會增加BPV中毒的閾值，延遲驚厥的發生。病理染色結果顯示，BPV會導致SD大鼠海馬DG區神經細胞壞死，而LE的使用減輕了BPV對大鼠海馬神經細胞的損害。由此可見，LE可以有效改善急性BPV中毒SD大鼠海馬DG區神經細胞的損害。

圖5 各組大鼠海馬DG區Nestin免疫組化結果（IHC×400）

有實驗證明[8]，在原代海馬神經元和星形膠質細胞共同培養狀態下，BPV可以直接作用于星形膠質細胞。在某些病理狀態下，星形膠質細胞會產生活化反應，GFAP作為中間絲蛋白的一種，是星形膠質細胞活化的標志物，同時GFAP作為神經干細胞的一種標志物，在成人腦DG區會呈星形膠質細胞樣的表達[9]。Nestin屬于Ⅵ類中間纖維絲蛋白，在腦損傷后反應性星形膠質細胞表達Nestin蛋白[10]，其免疫陽性細胞散在分布于大鼠海馬DG區，具有神經保護作用[11]。實驗證實Nestin陽性細胞有分化成星形膠質細胞的能力，腦缺血損傷使Nestin陽性細胞增多，且大部分Nestin陽性細胞與GFAP共表達[12]。此外，星形膠質細胞介導神經保護功能的過程涉及神經營養因子。例如BDNF的釋放[13]，在損傷等刺激因素的作用下，活化狀態的星形細胞可以調節這些神經生長因子分泌，對神經細胞發育和再生起重要作用。BDNF屬于神經營養素家族，在大腦回路發育、突觸和神經元網絡可塑性以及神經再生和神經保護中起著重要作用[14]。

本實驗中，通過采用免疫組織化學的方法檢測急性BPV中毒SD大鼠腦組織中GFAP、BDNF和Nestin蛋白在海馬DG區的表達，以此來探討LE對BPV神經毒性的解救機制。與Control組相比，BPV+NS組的GFAP陽性細胞數目增加，細胞突起變得粗短，著色加深，GFAP蛋白陽性表達率顯著升高，表明BPV與星形膠質細胞發生活化反應有關。與BPV+NS組比較，BPV+LE組和LE+BPV+LE組GFAP蛋白陽性表達均降低，陽性細胞形態趨于正常，表明使用LE后可以一定程度上改善星形膠質細胞的活化反應。鏡下觀察BDNF和Nestin蛋白的免疫陽性反應，發現與Control組相比，BPV+NS組BDNF和Nestin蛋白在海馬DG區的陽性表達明顯增高，神經細胞排列疏松，胞核有溶解破壞表現，染色較深，呈棕黃色或棕褐色。表明BPV損害大鼠海馬DG區后，神經干細胞激活，Nestin蛋白大量表達；同時這種損傷也誘發了BDNF的釋放。在給予LE治療后，BPV+LE組和LE+BPV+LE組的大鼠海馬DG區BDNF和Nestin蛋白的免疫陽性反應顯著降低，神經細胞形態趨于正常，只有少量的壞死細胞。以上結果提示，通過減輕星形膠質細胞活化反應可能會對急性BPV中毒的SD大鼠DG區神經細胞有保護作用。

BPV的急性中毒可能會引起SD大鼠海馬DG區神經細胞的壞死和星形膠質細胞的活化反應；這種應激反應會誘發BDNF和Nestin蛋白的釋放；LE可以快速逆轉BPV的急性中毒會引起SD大鼠驚厥癥狀，改變急性BPV中毒大鼠腦組織中GFAP、BDNF和Nestin蛋白的表達，改善星形膠質細胞活化反應，減緩神經元損傷，改善急性BPV中毒大鼠中樞神經損傷狀況。從LE的給藥方式上看，預處理與后處理均能有效逆轉BPV的神經毒性，雖然預處理組輸注了更多劑量的BPV，但兩組大鼠海馬DG區神經細胞的改變并無明顯差異。而預處理能夠延長發生驚厥的時間和增加BPV的安全閾值。在實際臨床工作中，使用局部麻醉藥時預先輸注LE，可能會對預防LAST的發生有一定的幫助，但是一旦在此基礎上發生LAST，由于輸注了更多劑量的局麻藥，解救難度將會增加，可能后果更加嚴重。

綜上所述，LE可以有效逆轉BPV的神經毒性，緩解SD大鼠BPV的急性中毒引發的驚厥反應，減輕大鼠海馬DG區神經細胞的損傷，這一毒性逆轉反應的機制可能是通過LE減輕急性BPV中毒的SD大鼠海馬DG區神經星形膠質細胞活化反應，進而對神經細胞發揮保護作用。但其具體作用機制及GFAP、BDNF和Nestin蛋白在大鼠海馬DG區與星形膠質細胞的關系仍需進一步進行體外細胞培養、共定位分析等研究。