甘蔗新基因ShUGT2的生物信息學分析及亞細胞定位

李延博 王俊剛 趙婷婷 張樹珍 熊國如

(1 海南大學園藝學院 海南?？?570228;2 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所∕中國熱帶農業科學院甘蔗研究中心∕海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室 海南?？?571101)

糖基轉移酶 （glycosyltransferases，GT）普遍存在于自然界生物體內，是一個龐大的基因家族，其作用是對糖基進行催化，將活性供體分子轉移到激素、次級代謝物、蛋白等大小分子上［1］，改變受體分子的生物活性、穩定性、水溶性、運輸特性、亞細胞定位及其與受體的相互識別等特性［2］。在植物體內最主要的糖基供體是尿核苷二磷酸糖基轉移酶（UDP－glycosyltransferases，UGT），又稱作UDP-糖基轉移酶，它對于維持植物的生長發育有著重要作用［1］。

近年來，國內外對于UDP-糖基轉移酶的研究較多，有很多UGT 基因在不同植物中被克隆出來，如擬南芥［3］、水稻［4］、小麥［5］、大豆［6］、煙草［7］等；對于它們的生物學功能也有進一步的研究，主要涉及植物的次級代謝、激素調節以及生長發育等幾個方面［8-10］。如UGT76C2跟細胞分裂素有關，在該基因的過表達植株中，細胞分裂素N-糖苷含量明顯上升，在沉默植株中則下降，證明UGT76C2通過糖基化影響了細胞生長和發育［11］。UGT73C5的過表達植株，其體內油菜素內酯減少且油菜素內酯糖苷增加，而抑制表達的株系結果正好相反，證明了UGT73C5通過調控植物體內油菜素內酯含量來調控植物生長發育［12］。而UGT74E2過表達則會導致植物體內生長素積累，從而導致植物生長緩慢，且出現矮小化等現象［13］。UGT78D1可以糖基化槲皮素和山奈酚的3-OH 位置，進而參與黃酮醇糖苷的生物合成［14］。

甘蔗（Saccharum officinarum）作為重要的熱帶經濟作物，同時也是最大的糖料作物，對中國乃至世界的食糖產業貢獻巨大［15］。甘蔗體內有著眾多的糖基轉移酶基因，但其在植物生長發育中的作用尚不清楚。為明確糖基轉移酶基因在甘蔗內的功能，本研究利用甘蔗轉錄組數據克隆出一個UDP-糖基轉移酶基因ShUGT2，對其生物信息學進行分析，通過構建亞細胞定位載體進行蛋白定位分析，運用半定量RT-PCR 技術確定該基因在甘蔗不同組織中的表達情況，為后續研究提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

甘蔗來源于中國熱帶農業科學院甘蔗研究中心儋州綜合試驗站甘蔗基地，水稻品種日本晴由武漢伯遠生物公司提供。

1.1.2 試劑

感受態細胞DH 5α 購自北京全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑盒、凝膠純化回收試劑盒購于生工生物工程有限公司；半定量RT-PCR試劑、Taq 酶、測序載體、cDNA 合成試劑盒購于TaKaRa公司，RNA 提取試劑盒購于Omega 公司；pCAMBIA1300-GFP載體由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗ShUGT2基因的克隆

取生長成熟期甘蔗品種ROC22葉片，按試劑盒說明書提取RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測可知，28S、18S 和5S 條帶清晰，無DNA 污染；紫外分光光度計測定RNA 濃度可知，RNA 樣品滿足后續試驗需要。cDNA 第一鏈合成按TaKaRa 公司說明書進行操作。根據甘蔗轉錄組數據設計全長序列引物ShUGT2-F 和ShUGT2-R（表1），以cDNA 為模板進行PCR 擴增，反應體系如下：cDNA 模板 1 μL，2 ×Taq 酶 12.5 μL， 引 物 ShUGT2-F 1 μL， 引 物ShUGT2-R 1 μL，ddH2O 9.5 μL，共 25 μL。擴增程序為：95℃ 7 min；95℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃2 min，30 個循環；72℃10 min。采用瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物，將目的片段切膠回收，連接到pMD19-T 載體，于 16℃培養 12 h；轉入 DH 5α 感受態細胞，PCR 驗證顯示，菌液呈陽性克隆；將陽性單菌落送上海生工生物工程技術有限公司進行測序。

表1 本實驗所用引物序列

1.2.2 生物信息學分析方法

利用NCBI 數據庫和DNAMAN 軟件進行序列多重比對，使用MEGA6.0軟件構建系統發育進化樹。運用 ProtParam 軟件 （https：//web.expasy.org/protparam/） 分析蛋白質理化性質， TMHMM Serverv.2.0 軟 件 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測其跨膜區，InterProScan軟件 （www. ebi. ac. uk/interPro/search/sequence-search）分析其結構域，使用SOPMA 軟件（https：//npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html） 進行蛋白二級結構分析， 用Swiss-Model 軟件（https：//swissmodel.expasy.org/） 進行蛋白三級結構建模。

1.2.3 ShUGT2蛋白的亞細胞定位

以pMD19-T 載體為模板，以ShUGT2-L-F 和ShUGT2-L-R為同源引物，進行PCR擴增，切膠回收目的片段；用限制性內切酶KpnⅠ單酶切pCAMBIA1300-GFP 載體，使其線性化；用DNA 回收試劑盒純化酶切產物；將目的片段和線性克隆載體連接，于37℃金屬浴30 min；隨后立即冰水浴5 min，轉入DH5α 感受態細胞，PCR 驗證菌液呈陽性克隆，使用試劑盒提取質粒。

挑取成熟期的水稻品種日本晴葉片，切割至0.2 mm 左右，置于10 mL 酶解液（1.25%Cellulose R10 和0.75 % Macerozyme R10）中酶解，黑暗真空30 min，50 r/min 酶解4 h；加入等體積W5 溶液，經120 目細胞篩過濾，以200 r/min 離心3 min，棄上清；加入1 mL W5 溶液洗滌原生質體，之后以200 r/min 離心3 min；棄上清，加入1 mL MMG 溶液重懸，暗保存。

吸10 μL （2 μg/μL） 質粒DNA 于2 mL 離心管，緩慢加入100 μL 原生質體懸浮液，并混勻；加入110 μL 40%PEG 溶液，緩慢混勻，黑暗條件下轉染15 min；加入400 μL W5 溶液，終止轉染，以120 r/min 離心2 min；去上清，加入1 mL WI 溶液，暗培養12 h?？瞻讓φ蛰d體pCAMBIA1300-GFP 操作同上。使用激光共聚焦顯微鏡觀察定位結果。

1.2.4ShUGT2半定量RT-PCR表達分析

取成熟期甘蔗ROC22 的根、莖、葉組織，按Omega 公司試劑盒說明書提取RNA，反轉錄合成cDNA；根據目的基因的cDNA序列設引物ShUGT2-YF 和 ShUGT2-Y-R （表 1），以GAPDH為內參基因［16］，引物測序合成由上海生工生物工程技術有限公司完成。以cDNA 為模板，進行PCR 擴增，擴增程序為：95℃ 5 min ；95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 20 s，28個循環；72℃10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用全自動數碼凝膠圖像分析系統觀察結果并拍照。

2 結果與分析

2.1 甘蔗基因ShUGT2的克隆及序列分析

圖1 甘蔗基因ShUGT2的PCR擴增產物

參考甘蔗轉錄組數據，利用Primer Premier 5.0 設計擴增引物ShUGT2-F 和ShUGT2-R，擴增出約1.8 kb 的目的基因片段（圖1）。將PCR 凝膠產物回收，連接pMD19-T 載體并轉化，測序后獲得1 867 bp長度的序列。序列分析表明，ShUGT2含有1 782 bp 的完整開放閱讀框，編碼593 個氨基酸，根據氨基酸多重序列（圖2）對比和系統進化樹（圖3）構建發現，該氨基酸序列與高粱的SbUGT2、玉米的ZmUGT2、谷子的SitUGT2、狗尾草的SvUGT2等具有較高的序列相似性，其中與高粱的SbUGT2（XP_002468380.1） 同源性最為接近，達到了92.45%。

圖2 不同植物UGT氨基酸多重序列比對分析

續圖2 不同植物UGT氨基酸多重序列比對分析

圖3 系統進化樹構建

2.2 生物信息學分析

通過理化性質分析可知，ShUGT2 編碼蛋白理論等電點（pI）為8.16，相對分子量為67.28 kDa，不穩定系數為48.68，是一種不穩定蛋白，疏水性指數為-0.338，預測其為親水性蛋白。富含精氨酸Arg（R）（10.5%）、丙氨酸Ala（A） （9.8%）、纈 氨 酸 Val （V）（8.8%）、 亮 氨 酸 Leu （L）（8.4%）、冬氨酸Asp（D）（7.3%）、甘氨酸Gly（G）（7.1%）等。

通過跨膜區預測發現，該蛋白具有1 個跨膜區，位于20～42 氨基酸的位置（圖4）。氨基酸序列的保守結構域分析顯示，ShUGT2 編碼的氨基酸具有UDP-糖基轉移酶家族的特征結構域，位于309～514個氨基酸（圖5）。二級結構分析顯示，該氨基酸存在α-螺旋、伸展鏈、β-轉角和無規卷曲。其中，有265 個氨基酸形成α-螺旋，占44.69%，84 個氨基酸形成伸展鏈，占14.17%；30 個氨基酸形成β-轉角，占5.06%；214 個氨基酸形成無規則卷曲，占36.09%（圖6）。進一步通過同源建模得到該氨基酸產物的三級結構圖（圖7）。

2.3 ShUGT2蛋白的亞細胞定位

通過同源重組技術，將經菌液PCR驗證（圖8）呈陽性克隆的菌液提取pCAMBIA1300-ShUGT2-GFP質粒，使用激光共聚焦顯微鏡觀察轉染后的原生質體的綠色熒光蛋白GFP表達情況。結果顯示，對照pCAMBIA1300-GFP 空載體在原生質體的每個部位都有表達（圖9-a），在線粒體上pCAMBIA1300-ShUGT2-GFP 融合載體發出綠色熒光，具有明顯的定位特征（圖9-b），因此推論ShUGT2 編碼蛋白是一種線粒體蛋白。

圖4 跨膜區預測

圖5 結構域分析

圖6 二級結構預測

圖7 三級結構建模

2.4 ShUGT2的半定量RT-PCR表達分析

選取甘蔗品種ROC22號葉片、莖和根部等組織器官，通過半定量RT-PCR 技術分析甘蔗ShUGT2基因的表達特性（圖10）。ShUGT2在甘蔗的葉片、莖和根部均有表達，但表達的特異性并不明顯。

圖8 菌液PCR鑒定陽性克隆電泳結果

3 討論

圖9 ShUGT2蛋白的亞細胞定位

圖10 半定量RT-PCR結果

UDP-糖基轉移酶在維持細胞的生長發育方面發揮了重要作用。植物在大自然中生存需要快速地適應不斷變化的內部和外部環境，其顯著反應即產生大量的次級代謝產物，而這些代謝物的產生往往需要大量的糖基化修飾，為了鑒定ShUGT2蛋白功能，本研究成功地從甘蔗中克隆出了編碼UDP-糖基轉移酶基因ShUGT2。該基因開放閱讀框長度為1 782 bp，編碼593 個氨基酸，在ShUGT2 蛋白序列中，包含了UDP-糖基轉移酶超家族的功能保守域IPR002495，屬于GT8 家族的木聚糖α-葡萄糖醛酸轉移酶。而GT8家族主要涉及木聚糖的生物合成，植物失去木聚糖基本上等于喪失了次生生長能力，會出現矮小化和不抽薹的現象，而適當提高木聚糖的合成可促進二次細胞壁的形成，使植物具有更強的支撐力和生長發育能力［17-18］。例如擬南芥中的糖基轉移酶基因GUX1（AtPGSIP1）和GUX2（AtPGSIP3）可催化葡萄糖醛酸連接到木聚糖主鏈，從而形成植物的側鏈，并幾乎參與植物木聚糖所有側鏈的合成［19］。

在對基因功能的研究發現，亞細胞定位與基因功能有著緊密聯系；蛋白質位于不同的細胞部位中，所行使的功能也不同。本研究利用融合綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）及原生質體瞬時表達技術對ShUGT2 編碼蛋白進行亞細胞定位。結果表明，該蛋白定位于線粒體中，主要在線粒體內行使其功能。而線粒體在細胞分化、細胞凋亡、調節細胞離子穩態以及調控細胞增殖與代謝等多種過程中都發揮了重要作用［20］。因此，ShUGT2 蛋白很可能參與線粒體的代謝過程，通過參與木聚糖的合成，來調控細胞內半纖維素成分，促進二次細胞壁形成，從而促進細胞發育，為植物的正常生長發育發揮了重要作用。

雖然已從很多不同的植物材料中分離出UDP-糖基轉移酶基因，但由于技術手段的局限性，一些基因的作用底物未被鑒定，作用機制尚未清楚，目前的研究方向多集中于植物的生長發育、代謝調節及激素平衡等方面。從半定量RT-PCR 中可看出，ShUGT2在甘蔗的根、莖、葉組織中均有表達。因此下一步的實驗重點，將對甘蔗不同組織器官（根、莖、葉等）、不同生長發育階段和不同影響因素下ShUGT2的表達特異性進行分析，對其展開更深入的研究。本研究為進一步分析該基因在甘蔗中的具體功能提供了依據。