藏羊皮膚組織中低氧促有絲分裂因子的表達(dá)及分布研究

趙曉萌，買雨晨，周 宇，喬自林,2,3，楊 琨,2,3*

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730100；2. 西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心；3.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室)

藏羊作為我國三大原始綿羊品系之一[1]，主要分布于青藏高原地區(qū)，其獨特的地理因素使藏羊具有較高的通氣量、血氧飽和度以及較低的肺動脈壓和血紅蛋白等特點[2]。且藏羊皮膚覆蓋于整個機(jī)體體表，具有保護(hù)深部組織免受外界機(jī)械刺激、光化學(xué)輻射及抵御寒冷的作用，是研究高原生物低氧適應(yīng)性的良好材料。

低氧促有絲分裂因子(hypoxia-induced mitogenic factor，HIMF)又稱炎癥區(qū)1(found in inflammatory zone 1，F(xiàn)IZZ1)或抵抗素樣分子-α(resistin-like molecule α，RELMα)，是抵抗素樣分子(resistin-like molecule/found in inflammatory zone,FIZZ/RELM)家族的一員[3]，該家族由FIZZ1/RELMα/HIMF，F(xiàn)IZZ2/RELMβ，F(xiàn)IZZ3/resistin和RELMγ組成[4]。其中低氧促有絲分裂因子始終以單體形式存在，其啟動子區(qū)域受多個炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，參與炎癥反應(yīng)調(diào)控、促進(jìn)血管形成及收縮、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)骨髓細(xì)胞趨化等生物學(xué)功能[5-6]。

本研究以藏羊皮膚作為實驗材料，應(yīng)用蘇木精-伊紅染色法和免疫組織化學(xué)法的方法來探究藏羊皮膚組織中低氧促有絲分裂因子的表達(dá)及分布情況以及低氧促有絲分裂因子對高原動物低溫耐氧的作用，旨在進(jìn)一步為低氧促有絲分裂因子對高原動物適應(yīng)低氧性的機(jī)制提供理論依據(jù)，具有高度的研究價值和創(chuàng)新意義。

1 材料與方法

1.1實驗動物 采取位于甘肅省臨夏回族自治州自然放養(yǎng)藏羊的健康皮膚組織。經(jīng)宰割后迅速將藏羊皮膚的蘇木精-伊紅染色樣本和免疫組化樣本放于4%的多聚甲醛中固定。

1.2實驗試劑 0.01 mol/L PBS磷酸鹽緩沖液、0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液、兔多克隆抗體HIMF、免疫組化試劑盒(SP-0023)、DAB顯色試劑盒(DA1015-3)，均來自于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3HE染色及免疫組化SP染色 藏羊皮膚樣本經(jīng)乙醇濃度梯度脫水、石蠟包埋后，切成厚7 μm的石蠟切片，進(jìn)行HE染色觀察其組織結(jié)構(gòu)的特點并應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法對切片進(jìn)行檢測。具體的HE染色及免疫組化SP染色方法依據(jù)說明書操作。

1.4圖像采集及結(jié)果判定 藏羊皮膚切片于顯微鏡照相系統(tǒng)下采集圖像。免疫組化染色結(jié)果依據(jù)著色程度深淺及著色面積判定。若低氧促有絲分裂因子在胞漿、胞核呈現(xiàn)深棕黃色或黃褐色則為強(qiáng)陽性表達(dá)，若棕黃色較淺則是弱陽性表達(dá)，處于強(qiáng)陽性與弱陽性之間是中性陽性表達(dá)，未出現(xiàn)棕黃色或與背景色相似的則為陰性表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1藏羊皮膚的組織學(xué)結(jié)構(gòu) 青海藏羊的皮膚組織學(xué)結(jié)構(gòu)與其它家畜的相似, 主要由表皮、真皮和皮下組織三部分組成[7]。其中初級毛囊較為粗長，從內(nèi)向外依次包括毛髓質(zhì)、毛皮質(zhì)、內(nèi)根鞘小皮、內(nèi)根鞘、外根鞘、纖維鞘等結(jié)構(gòu)，并伴有皮脂腺，其皮脂腺分泌部為幾個實心的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞較大且胞質(zhì)著色較淺，毛囊之間含有較多膠原纖維，次級毛囊較初級毛囊比細(xì)而小，且三毛群和一毛群數(shù)量較多(圖1)。

圖1 藏羊皮膚組織切片的HE染色法結(jié)果

2.2免疫組織化學(xué)表達(dá) 根據(jù)免疫組化表達(dá)陽性顏色的深淺可知，低氧促有絲分裂因子在藏羊皮膚的角質(zhì)層呈棕黃色的強(qiáng)陽性表達(dá)，在初級毛囊和次級毛囊的外根鞘、內(nèi)鞘小皮中有大量的陽性著色，為集中的陽性表達(dá)，在毛根呈現(xiàn)少量陽性表達(dá)，在藏羊的表皮和真皮中均未見表達(dá)(圖2)。

圖2 藏羊皮膚HIMF蛋白免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

3 討論

藏羊皮膚覆蓋于整個機(jī)體體表，在高原的低溫缺氧環(huán)境下最先進(jìn)行代償，作為氧感受器參與全身低氧反應(yīng)調(diào)節(jié)[8]。

HIMF作為一種低氧時小鼠肺組織分泌的分泌物為促成有絲分裂因子，在老鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和皮脂細(xì)胞中表達(dá)[9]，本研究則發(fā)現(xiàn)低氧促有絲分裂因子在藏羊皮膚的角質(zhì)層、初級毛囊和次級毛囊的外根鞘、內(nèi)鞘小皮以及毛根中存在表達(dá)，二者之間相互關(guān)聯(lián)。據(jù)研究表明，抵抗素樣分子在人類皮膚的免疫防御中具有重要作用，且這項研究揭示了抵抗素樣分子基因多態(tài)性與在皮膚(如尋常痤瘡和化膿性汗腺炎)中的作用[10]。然而若缺乏低氧促有絲分裂因子，皮膚的微生物群則會發(fā)生改變，有學(xué)者就利用了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因，靶向敲除小鼠的Retnla基因位點，驗證了Retnla小鼠皮膚中不存在促有絲分裂因子的結(jié)論[9]。

低氧促有絲分裂因子具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、分化、趨化、收縮血管及促進(jìn)血管新生等功能[11-12]，兼有炎癥因子和生長因子的共同特性且受多個炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。如低氧促有絲分裂因子能夠作為小鼠傷口中交替激活的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)Plod2[12]，在IL4Rα介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞賴氨酸羥化酶(lysyl hydroxylase2, LH2)的產(chǎn)生過程中發(fā)揮作用，使敲除IL4Rα基因的組織產(chǎn)生不良預(yù)后的作用[13]，IL-4和IFN-γ共同調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞FIZZ1的表達(dá)[14]，以及可以誘導(dǎo)HIF-1α在肺部的表達(dá)、誘導(dǎo)新生血管形成，通過依賴HIF-1α的信號通路上調(diào)VEGF及下調(diào)VEGFR2的表達(dá)等[15]。

本試驗得出低氧促有絲分裂因子在藏羊皮膚的角質(zhì)層呈現(xiàn)高度表達(dá)的狀態(tài)，在初級毛囊和次級毛囊的外根鞘、內(nèi)鞘小皮中呈中度表達(dá)、在毛根呈現(xiàn)少量表達(dá)的結(jié)果，表明二者存在一定關(guān)系，低溫缺氧能刺激低氧促有絲分裂因子在皮膚中的表達(dá)，對藏羊的生長發(fā)育起調(diào)節(jié)作用，但其具體的表達(dá)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

蘇木精-伊紅染色結(jié)果表明藏羊皮膚組織由表皮、真皮、皮下組織三部分構(gòu)成。通過免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)低氧促有絲分裂因子在藏羊的表皮、真皮中均未表達(dá)，在藏羊皮膚的角質(zhì)層呈棕黃色的強(qiáng)陽性表達(dá)，在初級毛囊和次級毛囊的外根鞘、內(nèi)鞘小皮中呈集中的陽性表達(dá)，在毛根呈現(xiàn)少量陽性表達(dá)。根據(jù)低氧促有絲分裂因子促進(jìn)藏羊皮膚組織表達(dá)的結(jié)果得出在低溫缺氧的條件下藏羊皮膚能夠表達(dá)低氧促有絲分裂因子的特性，進(jìn)而推測低氧促有絲分裂因子對高原動物低溫缺氧適應(yīng)性起著重要調(diào)節(jié)作用。