基于網絡藥理學的麻黃湯治療新型冠狀病毒肺炎潛在機制研究

龍慎豪，胡 衛，張 煒

(1.三峽大學，湖北 宜昌 443000；2.宜昌市中醫醫院，湖北 宜昌 443000)

新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19，以下簡稱“新冠肺炎”)給人民健康及社會穩定均帶來了巨大的負面沖擊。急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)是此次新冠肺炎患者的主要危重并發癥之一[1]，有研究發現重癥患者中年齡較大者有更多的潛在患病風險，從發病至發展為ARDS的時間為8.0天[2]。根據國家衛生健康委發布的新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)的通知[3]，本病以發熱、乏力、干咳為主要臨床表現；少數患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等癥狀；重型患者多在發病1周后出現呼吸困難和(或)低氧血癥，嚴重者快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙等。因此，能否針對ARDS形成快速有效治療，決定著是否能有效截斷病程，進而起到降低新冠肺炎患者死亡率的作用。

中醫藥在此次治療新冠肺炎方面顯示出了確切療效，不但能改善普通患者臨床癥狀、 縮短病程，還能防止重癥、危重癥患者的病情惡化[4]。從2020年2月6日起，國家中醫藥管理局和國家衛生健康委聯合發文推薦全國各地使用清肺排毒湯治療新冠肺炎[5]。從使用效果來看，清肺排毒湯對治療新冠肺炎具有良好的臨床療效和救治前景，最大程度提高了治愈率、降低了病死率[6]。有研究指出清肺排毒湯的起效關鍵在于有效地針對了此次疫情屬于“寒濕疫”的特性，尤其是本方中用到了麻黃湯來宣散透邪化飲[7]。麻黃湯出自漢代張仲景所著《傷寒雜病論》，由麻黃、桂枝、杏仁、甘草4味中藥組成。麻黃湯為治療外感風寒表實證的主要方劑，具有解表散寒、宣肺平喘、利水消腫等功效。

網絡藥理學能從生物網絡平衡的角度闡釋疾病的發生發展過程，從改善或恢復生物網絡平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導新藥發現。網絡藥理學通過對網絡的分析來闡明中藥復方多成分、多靶點的藥物協同作用機制，能為系統地理解中藥與疾病之間復雜關系提供依據[8]。本研究中，我們采用網絡藥理學和生物信息學方法探討麻黃湯作用于COVID-19的潛在機制。

1 方法

1.1 麻黃湯中活性成分收集與篩選

采用數據庫TCMSP(http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)[9]和TCM-ID(http：//www.megabionet.org/tcmid/)[10]，分別以4味藥的拼音名“mahuang”“guizhi”“xingren”“gancao”為關鍵詞檢索得到麻黃湯中含有的化合物成分。通過TCMSP平臺過濾器自定義篩選結果，選擇活性化合物的篩選條件：口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18。篩選出麻黃湯中各味中藥的活性成分后，分別通過各成分的Pub Chem CId號在數據庫Pub Chem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/)[11]中搜索得到各自對應的規范SMILES結構。

1.2 活性成分的潛在靶點預測

將各活性成分分子的規范SMILES結構輸入到數據庫Swiss target prediction (http：//www.swisstargetprediction.ch/)[12]中進行反向分子對接來預測靶點，選擇物種為“Homo sapiens”，只保留可能性大于0的靶點。最后，預測得到的所有靶點均采用Uniprot(https：//www.uniprot.org/)[13]數據庫進行基因名稱校正。

1.3 ARDS的已知治療靶點收集與篩選

疾病的已知治療靶點來自于CTD(http：//ctdbase.org/)[14]數據庫，輸入關鍵詞“ARDS”“acute respiratory distress syndrome”，得到與 ARDS相關的基因靶點，以CTD數據庫的推斷分數(Inference Score≥30) 作為篩選條件，篩選結果作為疾病的候選靶點。然后再利用Uniprot數據庫對所得疾病靶點進行基因名稱校正。

1.4 網絡構建

在上述預測靶點與疾病的已知治療靶點相互映射取交集后，將交集靶點投入到蛋白質相互作用分析平臺STRING(https：//string-db.org/)，種屬選擇“Homo sapiens”，獲取靶蛋白之間的相互作用關系，并將篩選條件設置為最高可信度“highest confidence(≥0.7)”，其余參數默認。剔除掉游離于網絡的靶點后，剩下的即為網絡核心靶點。再采用Cytoscape 3.7.1(http：//www.cytoscape.org/)[15]軟件來構建藥物-靶點-疾病復合網絡，對上述數據進行可視化分析。

1.5 候選靶點基因功能和通路富集分析

為了更好地說明上述所得到的網絡核心靶點的生物學過程(biological process)及其所涉及的信號通路情況，我們采用CTD(http：//ctdbase.org/)數據庫對這些靶點進行了GO富集分析及KEGG 富集分析，以錯誤發現率(FDR)≤0.05為篩選條件，并按照FDR值由小到大順序排列。

2 結果

2.1 麻黃湯活性成分篩選結果

通過檢索TCMAP和TCM-ID數據庫共得到976個化合物，其中符合篩選條件OB≥30%、DL≥0.18，且能以其SMILES結構預測靶點的化合物共有91個。在剔除掉重復項后，剩下78個唯一化合物成分，其中18個來自麻黃，7個來自桂枝，17個來自杏仁，49個來自甘草。麻黃湯中活性成分信息見表1。

表 1 麻黃湯中活性化合物

2.2 候選靶點篩選結果

先通過Swiss Target Prediction數據庫，利用上述活性成分的SMILES結構進行反向分子對接，剔除掉可能性為零的靶點及重復項后，共得到733個預測靶點。再通過檢索CTD數據庫，剔除掉重復項后，剩下2 837個疾病已知治療靶點。其中，復合CTD數據庫推斷分數(Inference Score≥30)篩選條件的靶點有102個。然后，將預測靶點和疾病已知治療靶點相互映射后，再將交集部分導入STRING數據庫，保留最高可信度“highest confidence(≥0.7)”的部分，得到24個候選靶點。候選靶點的基本信息見表2。

表2 麻黃湯靶點的基本信息

2.3 構建藥物-靶點-疾病網絡

以麻黃湯、藥物、24個潛在靶標及疾病ARDS作為節點，用Excel文件格式分別定義各節點及各連線的屬性和關系，通過Cytoscape 3.7.1 軟件進行數據編排和圖形處理，得到麻黃湯-藥物-靶標-疾病(ARDS)網絡，見圖1。該復合網絡共包含30個節點和86條邊，三角形節點代表方劑麻黃湯，菱形節點代表藥物，圓形節點代表藥物所作用的靶點，V形節點則代表疾病。其中，根據化合物所作用靶點的次數由小到大，圓形節點的顏色由淺到深漸變。

圖1 麻黃湯藥物-靶點-疾病網絡

2.4 候選靶點富集分析結果

通過CTD數據庫對24個候選靶點進行GO富集分析(FDR≤0.05)，得到GO(biological process)條目809條，其中靶基因主要參與氧化應激反應、細胞對細胞因子刺激的反應、細胞對化合物刺激的反應、細胞因子介導的信號通路、細胞凋亡過程、免疫系統進程、炎癥反應等生物學過程，見圖2。

圖2 麻黃湯作用靶點 GO (biological process)功能分析

此外，根據通路注釋分析(FDR≤0.05)結果，共得到信號通路249條。通過分析發現，候選靶點主要富集在免疫系統、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、NF-kappa B信號通路，與細胞凋亡、流行性感冒、基因轉錄、炎性小體等有密切聯系，見圖3。

圖3 麻黃湯作用靶點信號通路富集分析氣泡圖

3 討論

本研究中，我們采用網絡藥理學和生物信息學方法來探究麻黃湯防治COVID-19的潛在機制。通過對現有數據庫的檢索和篩選，一共鑒定出了78種符合篩選標準的生物活性成分，其中有一些活性成分為多種中藥所共有。例如β-谷甾醇(Beta-sitosterol)同屬于麻黃和桂枝；谷甾醇(Sitosterol)同屬于桂枝、杏仁和甘草；豆甾醇(Stigmasterol)同屬于麻黃和杏仁；山柰酚(Kaempferol)、槲皮素(Quercetin)、柚皮素(Naringetol)同屬于麻黃和甘草；甘草黃酮(Glabridin)、丁子香萜(Mairin)、甘草甙(Liquiritin)則同屬于杏仁和甘草等。在這78種活性成分中，有一些成分已經被研究報道過對ARDS有治療作用，例如山柰酚(Kaempferol)被發現能夠抑制核轉錄因子-κB(NF-kappa B)的活化從而降低促炎癥反應來實現治療ARDS的目的[16]；此外，甘草黃酮(Glabridin)被證實可以抑制炎癥反應，并通過抑制MAPK和ERK信號通路的活化來發揮對ARDS的治療作用[17]；一項研究表明槲皮素(Quercetin)對脂多糖誘導的肺部炎癥具有預防作用[18]；另一項研究則證實香木葉素(Diosmetin)能在一定程度上限制氧化損傷，以及限制炎癥細胞的積累和促炎細胞因子的分泌[19]。基于上述已被研究報道的事實，我們推測麻黃湯是通過其中多種活性成分協同發揮作用來治療ARDS的。

結合我們所構建的藥物-靶點-疾病網絡和蛋白質相互作用網絡分析發現，麻黃湯中的眾多活性成分可能是通過作用于EGFR、PTGS1、MMP2、PTGS2、MMP9、NOS2、AKT1、IL2、TNF和IL6等靶點，整體實現對ARDS的治療作用。其中，有一些靶點出現的頻次比較高，如EGFR為36種活性成分所共有，其頻次為36；PTGS1頻次為33；MMP2和PTGS2的頻次同為28等，詳見表1、圖1。這種現象表明麻黃湯中的多種活性成分，通過選擇性靶向多種蛋白，從而實現對ARDS更全面、更廣泛的治療效果。

一項臨床研究表明，COVID-19患者從入院發展至ARDS的最短時間為2天，需要經ICU和吸氧治療，且患者體內細胞因子風暴與疾病嚴重程度相關[20]。目前，ARDS的具體發病機制仍然模糊，但越來越多研究傾向于認同是由多種相關靶蛋白，以及這些蛋白參與的多種信號通路來共同主導調節的急性肺損傷的炎癥反應過程。ARDS的誘發因素之一為病毒引起的流行性感冒，在感染后期，病毒往往會引起肺組織上皮細胞凋亡和壞死[21-22]。從我們構建的網絡預測結果來看，麻黃湯主要是通過靶向IL2、IL6、AKT1、BCL2、GSK3B、MAPK1、CASP3和TNF等蛋白來干預和調節細胞的凋亡過程。有研究表明肺動脈內皮細胞產生細胞因子如IL6、TNF等會在肺部感染期間響應病毒而招募白細胞加重炎癥損傷[23]。從網絡圖中還可以看到，麻黃湯能通過作用于PTGS1、PTGS2、EGFR、AKT1、IL6、RELA等靶點來調控炎癥反應，還能通過作用于NOS2、MMP2、MMP9、MPO、IL2、IL6、AKT1、BCL2等來調控免疫系統進程。有研究表明，免疫細胞所分泌的細胞因子如白細胞介素、腫瘤壞死因子、趨化因子、干擾素等均參與到了ARDS的疾病進程。當有外界病原體入侵并作用于免疫細胞時，會促使免疫細胞分泌更多細胞因子，用于招募和激活更多的免疫細胞，促進形成免疫系統的正反饋。然而，當免疫系統被過度激活時，大量細胞因子會蓄積，以細胞因子風暴的形式爆發，并最終損傷機體重要器官的正常細胞，導致多器官功能衰竭[24]，這說明炎癥反應與免疫系統均與ARDS相關。有報道指出ARDS可加快機體分解代謝，從而消耗過多的能量引起機體營養不良，導致免疫功能出現損傷，而中藥能有效提高ARDS的免疫功能[25]。此外，研究表明中藥還可以通過調節炎性介質、抗氧化作用、調節基質金屬蛋白酶、保護內皮功能等多種方式來治療ARDS[26]。肺泡上皮和內皮毛細血管膜的炎癥損傷是ARDS的一個中心事件，涉及MMP2、MMP9等靶點參與調控基底膜的降解過程[27]。

從通路富集分析結果可知，麻黃湯在發揮過程中主要涉及到的通路有：TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、Toll-like 受體信號通路、NF-kappa B 信號通路等，見圖3。研究發現ARDS時可激活PI3K-Akt 信號通路的細胞凋亡信號分子和凋亡相關的蛋白調節肺組織上皮細胞凋亡，從而顯著增加肺水腫和肺組織損傷面積[28]。同樣，也有研究表明脂多糖能通過MAPK和ERK通路誘導肺成纖維細胞核小鼠肺組織的炎癥反應[29，30]。此外，還有報道指出Toll-like 受體是一種可調節病原體識別并激活先天免疫，同時激活并放大多種組織的炎癥反應的模式識別抗體，出現肺損傷時Toll-like 受體信號通路中的相關分子，如 NF-κB 可明顯激活，從而增加體內外炎性細胞因子水平[31]。基于上述文獻研究以及我們對復合網絡靶點及通路的分析結果，我們推測麻黃湯主要是通過靶向多個靶點來調節免疫功能、抑制炎癥反應和調控內皮細胞凋亡過程等來截斷ARDS病程，從而最終達到治療COVID-19的目的。