色譜聯用技術在中藥及民族藥物代謝組學研究中的應用進展

蘇日古嘎，陳佳麟，徐 寧，王曦燁，許 良

(內蒙古民族大學 化學化工學院，內蒙古 通遼 028042)

代謝組學是研究生物系統對病理生理刺激或基因修飾的動態多參數反應的定量測量的學科，它主要研究細胞、體液、排泄物或器官勻漿中小分子有機代謝物的變化[1]。代謝組學分析技術主要有核磁共振、氣相色譜-質譜聯用、液相色譜-質譜聯用、電泳-質譜聯用及等離子體質譜等。色譜-質譜聯用技術結合了色譜卓越的分離能力與質譜準確的定性定量優勢，符合現代中藥代謝組學分析的要求，已成為目前應用最廣泛的分析技術[2]。氣相色譜-質譜聯用技術具有靈敏度高，抗干擾能力強、重復性好、分析速度快、進樣量少，且檢測效果顯著、分離效果好等優勢，可用于分析組分復雜的血液樣品。氣相色譜-質譜聯用技術繼承了氣相色譜分離效果好的特點，并兼顧了質譜儀專屬性強的特點，可以在血液中干擾物質較多的情況下進行多組分分析[3]。樣品在氣相色譜-質譜聯用技術分析前一般需要比較復雜的預處理步驟，包括樣品純化及衍生化，該法不適合分析熱不穩定的代謝物[4]。而液相色譜-質譜聯用技術分析方法對樣品前處理方法并無過高要求，生物樣品經蛋白沉淀、液液萃取或固相萃取純化富集后，可直接用于液相色譜-質譜聯用技術檢測分析[4]。液相色譜-質譜聯用技術是代謝組學中用于定量分析內源性化合物的主要技術手段，具有分析時間短、完全自動化、所需樣品制備量少等優點，適用于相對分子質量與極性范圍廣泛的內源性分析物[5]。本文綜述氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)在中藥及民族藥代謝組學中的應用進展，以期為中藥及民族藥物的進一步研究提供參考。

1 色譜聯用技術在藥物代謝中的應用

1.1 GC-MS技術在中藥代謝組學研究中的應用

氣相色譜-質譜聯用技術應用于中藥單味藥研究，對于全面、客觀地闡明中藥單味藥的作用機制、質量評級等方面具有重要的意義。徐婷婷等[6]采用氣相色譜-質譜聯用技術檢測了大鼠給予商陸后尿液中代謝產物的變化，發現腎損傷機制可能是通過影響三羧酸循環、氨基酸代謝等通路，進而引起氧化應激反應及細胞凋亡的發生。ZHANG Y等[7]利用GC-MS技術表明了金針菇多糖通過降低天冬氨酸轉氨酶與丙氨酸轉氨酶水平，增強抗氧化作用，減輕病理性損傷，對急性肝損傷起到肝保護作用。QI Y P等[8]采用氣相色譜-質譜聯用技術發現了急性炎癥大鼠經白玉蘭揮發油預處理后，十六烷酸、亞油酸、油酸、硬脂酸及膽固醇等代謝產物出現顯著變化，而這正是白玉蘭揮發油抗炎機制的合理解釋。牟菲等[9]采用氣相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用技術發現了冠心病心血瘀阻證大鼠血清標志物主要與糖代謝、脂代謝及氨基酸代謝通路相關，而蘇合香可調節模型組大鼠體內紊亂的代謝通路。杜毅等[10]利用氣相色譜-質譜聯用儀發現了結晶腎損傷相關的生物標志物與嘌呤代謝物、氨基酸代謝物、脂肪酸等代謝物有關，表明金錢草提取物可通過調節失衡的代謝途徑從而發揮預防及治療結晶腎損傷的作用。張艷等[11]采用氣相色譜-質譜聯用技術發現了平菇多糖可通過調節肝損傷病大鼠尿液中的十六烷酸和1，2，3-丙烷酸水平，以及三羧酸循環、乙醛酸和二羧酸代謝、抗壞血酸和醛酸、檸檬酸、蘋果酸、D-葡萄糖醛酸等代謝通路改善肝損傷癥狀。常晉霞等[12]采用GC-MS代謝組學表明了刺五加總苷提取物具有降糖作用，其機制可能與調節能量代謝、氨基酸代謝、氨基酸生物合成及有機酸代謝相關。

中藥復方發揮治療對應證候的效果絕不是單味藥物之間的簡單加和，而是取決于質與量的關系，不同的質與量的組合發揮的治療效果則不盡相同[13]。HUANG B X等[14]采用GC-MS代謝組學方法發現了高尿酸血癥大鼠體內代謝產物的變化主要與甘油脂代謝、氨基酸代謝、原發性膽汁酸代謝、牛磺酸及次牛磺酸代謝、嘌呤代謝有關，推測二妙丸可能是通過將多種干擾途徑恢復到正常狀態來達到其抗高尿酸血癥的作用。周倩等[15]采用氣相色譜-質譜代謝組學技術表明了芪附湯可能是通過調節失衡的三羧酸循環、二羧酸代謝及花生四烯酸等代謝通路實現抗阿霉素心臟毒性的作用。趙小華等[16]采用氣相色譜-質譜法測定了小青龍湯證大鼠血液中內源性代謝物。結果表明，小青龍湯證表現的能量代謝、免疫功能、炎癥反應與乳酸、甘氨酸等標記物有關。JIANG Y等[17]采用氣相色譜-質譜聯用技術分析發現血必凈治療膿毒癥的機制主要與能量代謝、葡萄糖代謝及氨基酸代謝的紊亂有關。李莎等[18]采用氣相色譜-質譜方法表明了血必凈注射液通過調節能量代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝及糖代謝發揮治療百草枯中毒大鼠的作用。李瑩等[19]基于GC-MS代謝組學方法發現了四逆湯中甘草涉及糖酵解、脂質代謝、三羧酸循環及部分氨基酸等生物代謝途徑，推測甘草可通過以上代謝途徑減低附子的毒性。

1.2 GC-MS技術在民族藥代謝組學研究中的應用

民族藥是中國少數民族醫藥體系的重要組成部分，是少數民族人民用于預防、治療及保健的天然藥物。CHI A P[20]等采用氣相色譜飛行時間質譜發現了藏藥五味子多糖主要與TCA循環代謝途徑，以及丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝途徑有關，藏藥五味子多糖對慢性疲勞綜合征的治療機制部分歸因于這些紊亂途徑的恢復。覃一楓等[21]采用 GC-MS 技術發現蒙藥甘草總黃酮主要通過調節亞油酸及α-亞麻酸代謝起到減輕伊立替康胃腸道毒性作用。胡佳慧等[22]采用氣相色譜與質譜聯用的細胞代謝組學方法表明了姜黃素通過干擾腫瘤細胞的能量代謝、氨基酸代謝、微管體系、蛋白質合成及氧化應激反應等從而產生抗腫瘤機制。周亞敏等[23]采用GC-MS技術表明了蒙藥玉竹多糖通過調節糖代謝、能量代謝、氨基酸代謝及脂類代謝等對甲亢陰虛發揮預防作用。謝輝輝等[24]采用氣相色譜與質譜聯用技術發現烏頭堿及苯甲酰烏頭原堿主要通過影響氨基酸代謝產生生殖毒性作用。

采用氣相色譜-質譜聯用技術對復方民族藥進行藥效物質基礎及作用機制的研究已有報道。鄺婷婷等[25]利用GC-MS代謝組學技術發現三果湯散對高原紅細胞增多癥具有干預作用。孫潤彬等[26]采用GC-MS方法表明了昆布與蒙藥甘草單煎與合煎提取物給藥對三羧酸循環、脂肪酸β氧化、支鏈氨基酸以及糖代謝中間物均產生影響，合煎給藥造成大鼠腎臟損傷較為明顯，揭示了了蒙藥甘草加重昆布的腎臟毒性作用。藏藥黃芪具有補氣固表、托毒排膿、利尿、生肌等功效。王守麗等[27]采用氣相色譜-質譜發現黃芪湯中的主要成分芒柄花素及芒柄花素葡萄糖苷的水平在服藥后均顯著升高，而色氨酸、苯丙氨酸及膽酸等物質顯著降低，表明這些代謝物與肝病及糖尿病的防治有關。

1.3 LC-MS技術在中藥代謝組學研究中的應用

液相色譜-質譜聯用技術是目前中藥代謝組學應用最廣泛的分離技術，利用液相色譜的高分離效能與質譜的強鑒定能力研究中藥單味藥，可為中藥合理用藥提供科學依據。馬致潔等[28]采用液相色譜-質譜方法發現了何首烏造成肝損傷的動態機制及肝臟自我修復表現。WANG X Y等[29]采用超高效液相色譜結合四極桿飛行時間質譜代謝組學方法揭示出白豆蔻主要通過調節磷脂代謝途徑對慶大霉素誘導的急性腎損傷大鼠起到保護作用。于棟華等[30]運用UPLC-Q-TOF-MS方法揭示了穿山龍提取物可能是通過促進半胱氨酸及甲硫氨酸代謝中胱硫醚向半胱氨酸的轉化水平，上調色氨酸代謝中褪黑激素，從而實現對痛風性關節炎的防治作用。常晉霞等[31]采用UPLC-MS/MS識別方法發現了刺五加提取物發揮降糖作用可能與調節氨基酸、能量及脂代謝相關。趙一懿等[32]采用超高效液相色譜與三重四級桿飛行時間質譜聯用技術為銀杏葉提取物質量標準化研究提供了有力的實驗依據。

液相色譜-質譜聯用技術將研究對象作為一個整體進行研究，闡明中藥復方藥效物質基礎及作用機制，是研究中藥復方中復雜關系的最有效分析手段。YU X H等[33]采用液相色譜-質譜聯用技術觀察到養心湯干預組血清中潛在代謝標志物水平明顯高于對照組，表明潛在的代謝標志物可用于診斷不穩定型心絞痛患者。彭琳秀等[34]采用基于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS代謝組學技術發現復方祖師麻片主要通過下調溶血磷脂酰膽堿的水平從而達到治療效果。李慧等[35]基于大鼠血漿的UPLCQ-TOF-MS代謝組學方法研究了正天丸治療偏頭痛的機制，研究結果表明，正天丸通過治療偏頭痛的代謝組學機制可能與磷脂酰膽堿、3，4-二羥苯乙二醇等化合物有關。GU Y Y等[36]基于UPLC-Q-TOF-MS代謝組學技術揭示了雙黃連注射液可提高過敏反應大鼠血清組胺及類胰蛋白酶水平，主要與亞麻酸、苯丙氨酸、氨基酸、2-氧酸、嘌呤等代謝途徑相關。LIU Y Y等[37]通過采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜發現甘草附子湯通過黃酮類、皂苷類、生物堿類的配伍可調節多種代謝途徑的干擾達到治療效果。馬詩瑜等[38]基于UPLC-TOF-MS代謝組學技術發現大川芎方多組分中藥制劑對急性偏頭痛大鼠模型體內的差異代謝物有一定的回調作用，其作用機制主要與氨基酸代謝及犬尿氨酸的代謝有關。李澤華等[39]采用高效液相色譜聯用四級桿飛行時間質譜技術表明了芍藥甘草湯通過調節氨基酸、能量代謝失衡緩解過敏性哮喘。NIU X Y等[40]采用UHPLC-Q-TOF-MS分光光度法表明酸棗仁湯總多糖通過調節維生素、鞘脂、膽汁酸、磷脂及酰基肉堿等代謝途徑從而抑制免疫缺陷刺激引起的失眠。閆廣利等[41]利用UPLC-Q-TOF-MS技術發現茵陳蒿湯及其組分配伍均能顯著減少肝臟細胞炎性浸潤及肝纖維化。楊波等[42]采用UPLC-HDMS代謝組學方法發現了附子與甘草配伍后對其中10個毒性生物標記物具有明顯的回調作用，表明附子與甘草配伍后可有效降低附子的毒性。劉職瑞等[43]采用LC-MS代謝組學方法發現了百合知母湯通過調節脂肪酸酰胺代謝、苯丙氨酸代謝、甘氨酸代謝及脂質代謝等代謝通路發揮抗抑郁作用。

1.4 LC-MS技術在民族藥代謝組學中的應用

近年來，液相色譜-質譜聯用技術在民族藥藥物作用機制的代謝組學研究方面得到廣泛應用。藏藥三七具有化瘀止血，活血定痛的功效。申文雯等[44]采用UPLC-Q-TOF-MS技術闡明了蒸三七主要活性皂苷類組分在體內發揮藥效與脫糖、硫酸化、脫羥甲基化、葡萄糖醛酸化、支鏈丟失等代謝途徑有關。張晶等[45]采用超高效液相色譜-電噴霧飛行時間質譜技術分析了注射苗藥鐵筷子中3個香豆素化合物在大鼠體內的代謝變化，發現所涉及的代謝反應為葡萄糖醛酸化、磺酸化、還原等。艾小鵬等[46]采用LC-MS代謝組學技術方法揭示了藏藥小檗皮對 STZ 誘導糖尿病腎病大鼠的保護機制可能與上調糖尿病腎病大鼠血清中的鳥氨酸含量，參與精氨酸與脯氨酸的代謝有關。郭娜等[47]采用超高效液相色譜聯用四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜技術表明了肉豆蔻-8散可有效調節氨基酸代謝與脂肪酸代謝失衡，對心肌缺血再灌注損傷起到預保護作用。李樹穎等[48]采用LC-MS代謝組學方法發現了藏藥黃芪多糖對小鼠活性的影響，發現其作用機制主要與氨基酸代謝、能量代謝及抗氧化作用等有關。紅禾麻為貴州苗族民間用藥，具有祛風除濕、活血化瘀、利尿等功效。時慶欣等[49]使用UPLC-QTOF-MS/MS技術發現了紅禾麻降低血脂作用主要涉及體內脂質、糖類、維生素、氨基酸類成分的調控。楊改青等[50]采用液相色譜-質譜聯用儀揭示了杜仲葉飼料影響綿羊的營養代謝、生理狀態及免疫反應的作用機制主要涉及體內葡萄糖、脂肪酸及氨基酸等的代謝。此外，還與動物的免疫機能相關。蔡志偉等[51]采用UPLC-Q-TOF-MS探討了藏藥大黃配伍厚樸治療大鼠急性胰腺炎病癥的作用機制。結果表明，療效最佳組與模型組區別的23種潛在標記物中下調3種、上調20種，為大黃厚樸組分配伍對急性胰腺炎療效機制研究提供了重要線索。韓紅祥等[52]等采用超高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜聯用技術闡明了藏藥五味子發揮治療糖尿病并發癥的作用與能量代謝、氨基酸代謝、腸內菌代謝、脂類代謝等有關。胡堯等[53]利用液相色譜-質譜聯用技術發現了藏藥紅景天消除運動疲勞的作用機制可能與保護細胞膜、調節1，25-(OH)2D3→磷酸肌醇、甘油二酯通路，以及緩解運動后肌肉緊張度有關。迪麗索耶爾·亞勒坤木等[54]采用UPLC-Q-TOF-MS代謝組學方法發現了靈芝多糖可能通過調節牛磺酸及亞牛磺酸、甘油磷脂、D-谷氨酰胺與D-谷氨酸等代謝途徑來發揮輻射防護作用。

不同的單味藥組合成民族藥復方的治療作用遠大于單味藥的單一療效，僅使用單味藥往往難以達到更好的治療效果。李杰等[55]采用超高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術，探討了參麥方中蒙藥人參與麥冬配伍的物質基礎及作用機制；結果表明，參麥方是通過調節嘌呤、部分氨基酸、脂肪及能量代謝等代謝途徑發揮保護心肌損傷作用。劉丹丹等[56]采用高效液相與質譜聯用的方法研究了蒙藥訶子對于生草烏的減毒存效作用機制。結果表明，生草烏可使大鼠血清中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、肌紅蛋白及肌鈣蛋白的含量明顯升高，蒙藥訶子可降低谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、肌紅蛋白及肌鈣蛋白的含量，表明訶子對生草烏具有減毒作用。王靜等[57]基于 UHPLC-Q-TOF-MS 分析技術發現了藏藥多血康膠囊通過糾正能量代謝、氧化應激代謝、脂質代謝、腸道菌群等代謝通路來治療高原紅細胞增多癥。藏藥麻黃經常被用于治療風濕痹痛及陰疽、咳痰等病癥。孫啟慧等[58]采用LC-TOF-MS方法發現了麻黃細辛附子湯可通過調節能量代謝途徑，使其他甘油磷脂類物質趨于正常水平，表明了麻黃細辛附子湯對于腎陽虛外感病證具有良好的治療作用。維吾爾族藥紅花為具有活血化瘀、散濕去腫的功效。董娟妮[59]利用高效液相-質譜代謝組學技術發現了紅花-甘草藥對通過調節寒凝血瘀模型大鼠體內的組氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、嘌呤、嘧啶及核黃素代謝通路及檸檬酸循環改善寒凝血瘀證。

2 色譜-質譜聯用技術的應用展望

色譜-質譜聯用技術是中藥及民族藥的藥效物質基礎、指紋圖譜、譜效關系、配伍規律等現代化研究的重要技術平臺。目前，中藥及民族藥的代謝組學研究面臨新的挑戰，即需要更多、更全面的物質代謝數據信息，以便形成藥物作用機制更加完整的證據鏈。隨著質譜儀檢測靈敏度的提高，顯現中藥及民族藥物更多微量成分的代謝信息終將變為現實。一些復雜生物樣品處理方法的改進，如“液-液微萃取”技術有效解決了中藥及民族藥生物樣品前處理時揮發性成分易損失的問題，進而擴大了氣相色譜-質譜的應用范圍。此外，整合代謝組學數據與基因組學、蛋白質組學及臨床代謝數據，建立完善的數據庫，才能更好闡釋中藥及民族藥藥效物質基礎及整體作用機制。因此，色譜-質譜聯用技術在中藥及民族藥物的蛋白質組學、代謝組學研究中前景廣闊。