基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討消痛湯治療痛風(fēng)的作用機制

胡子毅，張 平，李人亮，易 瑩，賴俊宇，陳麗莎

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 急診科，江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330004；4.江西中醫(yī)藥大學(xué) 心血管病科，江西 南昌 33006)

痛風(fēng)是由單鈉尿酸鹽(MSU)沉積所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病，與嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)，特指急性特征性關(guān)節(jié)炎和慢性痛風(fēng)石疾病，主要包括急性發(fā)作性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石形成、痛風(fēng)石性慢性關(guān)節(jié)炎、尿酸炎腎病和尿酸性尿路結(jié)石，重者可出現(xiàn)關(guān)節(jié)殘疾和腎功能不全[1-2]。原發(fā)性痛風(fēng)的病因和發(fā)病機制尚不明確，發(fā)病多與遺傳和環(huán)境因素相關(guān)。在我國各地區(qū)痛風(fēng)的患病率為0.03%～10.47%[3]。目前臨床上對此病的干預(yù)主要依靠使用藥物和飲食控制相配合，嚴重者需行手術(shù)治療[4]。

消痛湯系蔣小敏教授治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗方，其藥物組成：炒杜仲30 g，粉萆薢15 g，白術(shù)10 g，百合25 g，漢防己10 g，金錢草15 g，車前草15 g，威靈仙20 g土茯苓10 g，黃柏10 g，牡丹皮10 g，伸筋草15 g，忍冬藤30 g，生甘草6 g[5]。本課題組曾運用消痛湯加味對40例急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者進行臨床研究，結(jié)果表明消痛湯治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有較好的療效，且具有一定的降尿酸作用[6]。但由于中藥復(fù)方具有成分復(fù)雜和作用機理不清楚的特點，因此本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法來探尋消痛湯中治療痛風(fēng)可能存在的關(guān)鍵活性成分和作用機制。

1 研究內(nèi)容與方法

1.1 消痛湯活性成分的獲取及靶點篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)對消痛湯中中藥的全部化學(xué)成分進行收集，通過限制口服吸收利用度(OB≥30%)、藥物相似性(DL≥0.18)對中藥的活性成分進行篩選[7]。然后將篩選好的候選活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫和SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫(http：//swisstargetprediction.ch/)中收集蛋白靶點。最后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)進一步將收集到的蛋白靶點轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的基因名稱，獲取與活性成分作用相關(guān)的蛋白靶點(人源)。

1.2 痛風(fēng)的靶點篩選

以“gout”“gouty”“Acute Gouty Arthritis”為關(guān)鍵詞，在Genecard數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//omim.org/)、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(https：//www.pharmgkb.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http：//db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https：//www.drugbank.ca/)中進行檢索，收集痛風(fēng)的相關(guān)基因。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將獲取到消痛湯活性成分的預(yù)測靶點與痛風(fēng)疾病相關(guān)靶點進行Venn(維恩)分析，篩選出“藥物-疾病”的交集基因。應(yīng)用Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建消痛湯的“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，探究消痛湯活性成分和相關(guān)靶點的相互作用。然后從Tools工具欄中“NetworkAnalyzer”模塊選擇Analyze Network功能，對藥物進行拓撲分析。在String 數(shù)據(jù)庫(http：//stringdb.org/)，通過交集得到的靶點構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。物種設(shè)為“Homo sapiens” (人類)，最低相互作用閾值設(shè)為最高置信度0.9 “highest confidence”，其余參數(shù)保持默認設(shè)置。然后把PPI網(wǎng)絡(luò)計算出的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，利用其Apps工具欄中的CytoNCA功能對其進行打分，篩選出核心基因。

1.4 基因本體論(GO)與京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析

應(yīng)用 R 4.0.2軟件中的BiocManager軟件包對上述交集基因進行GO和KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選及靶點篩選

本研究中通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得消痛湯中杜仲、粉萆薢、白術(shù)、百合、防己、金錢草、車前草、威靈仙、土茯苓、黃柏、牡丹皮、伸筋草和甘草13味藥物中的化學(xué)成分，通過限定OB≥30%和DL≥0.18進行篩選，共得到234個活性成分，其中杜仲28個、粉萆薢2個、白術(shù)7個、百合7個、防己3個、金錢草10個、車前草10個、威靈仙7個、土茯苓15個、黃柏37個、牡丹皮11個、伸筋草5個和甘草92個。剔除未找到靶點的化學(xué)成分后，共得到156個，見表1。

表1 消痛湯“中藥-活性成分-預(yù)測靶標”信息

2.2 疾病靶點篩選結(jié)果

通過Genecard數(shù)據(jù)庫、PharmGkb數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫和DrugBank數(shù)據(jù)庫篩選出與痛風(fēng)疾病相關(guān)基因830個。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與結(jié)果分析

將所得到的溫膽湯的藥物靶點與痛風(fēng)疾病相關(guān)靶點進行映射，得到146個共有靶點，見圖1。借助Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖2。對藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)的拓撲屬性進行分析，篩選出度值與介數(shù)均大于平均值的化合物，結(jié)果篩選出槲皮素、山柰酚、木樨草素、柚皮素、吳茱萸次堿等15種化合物，提示這些成分可能是消痛湯治療痛風(fēng)疾病的主要活性成分，見表2。利用String數(shù)據(jù)庫將映射所得的146個靶點制作成 PPI 網(wǎng)絡(luò)，限定其置信度為0.9，其產(chǎn)生相互作用的網(wǎng)絡(luò)有142個節(jié)點、558條邊，平均節(jié)點度：7.86，平均局部聚類系數(shù)：0.526，見圖 3。應(yīng)用Cytoscape軟件的Apps工具欄中的CytoNCA功能對PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)進行分析，篩選出12個核心基因，即TNF、IL1B、IL6、IL10、CCL2、CCL5、TIMP1、STAT3、CXCL1、PF4、CXCL8、VEGFA，說明這12個基因可能是消痛湯治療痛風(fēng)的關(guān)鍵靶標，見圖4。

圖1 消痛湯與痛風(fēng)的共有靶點

注：靶點；○成分。分別代表：1.白術(shù)；2.車前草；3.杜仲；4.防己；5.粉萆薢；6.甘草；7.黃柏；8.金錢草；9.牡丹皮；10.伸筋草；11.土茯苓；12.威靈仙

表2 化合物拓撲分析結(jié)果

圖 3 消痛湯治療痛風(fēng)疾病的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖 4 PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因

2.4 GO和KEGG通路富集分析

應(yīng)用R軟件的BiocManager軟件包對消痛湯治療痛風(fēng)的交集基因進行GO分類富集和 KEGG通路富集分析。依據(jù)P<0.05 進行GO和KEGG通路富集分析，其中富集靶標越多、P值越小的通路，與消痛湯治療痛風(fēng)的關(guān)系越密切，分別篩選出前10條GO條目和前20條KEGG通路。GO分類富集分析包括細胞組分(cellular component，CC)、生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)3個部分。通過GO分類富集分析確定了2 319個條目，其中涉及生物過程2 160條，主要參與對脂多糖的反應(yīng)、對細菌來源分子的反應(yīng)、細胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、肽基-酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、肽分泌的調(diào)節(jié)、細胞對脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細胞對細菌來源分子的反應(yīng)、蛋白質(zhì)分泌的調(diào)節(jié)、受體信號通路通過JAK-STAT的正調(diào)控等；涉及細胞組分44條，主要包括質(zhì)膜的外側(cè)面、囊腔、分泌顆粒腔、胞質(zhì)小泡腔、血小板α顆粒管腔、血小板α顆粒、含膠原蛋白的細胞外基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、MHC蛋白復(fù)合物、三級顆粒腔等；涉及分子功能114條，主要包括受體配體活性、信號受體激活劑活性、細胞因子活性、細胞因子受體結(jié)合、氧化還原酶活性、類固醇羥化酶活性、生長因子活性、生長因子受體結(jié)合、血紅素結(jié)合等，見圖5。通過KEGG 通路富集分析，找到了112條信號通路，主要包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、細胞因子-細胞因子受體間質(zhì)、炎癥性腸病、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、結(jié)核病、美洲錐蟲病、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、甲型流感、JAK-STAT信號通路、人巨細胞病毒感染、利什曼病、Th17細胞分化、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、弓形蟲病、瘧疾、百日咳、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、阿莫伊比阿斯病、NF-κB信號通路、化學(xué)致癌作用、HIF-1信號通路等，見圖6。

圖 5 GO分類富集分析結(jié)果

3 討論

本研究篩選出消痛湯與痛風(fēng)疾病的交集基因有146個，構(gòu)建出藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖后，通過拓撲分析找出槲皮素、山柰酚、木樨草素等15種主要活性成分。黃嘌呤氧化酶(XOD)是人體內(nèi)產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵酶，其抑制劑可用于治療高尿酸血癥和痛風(fēng)，研究表明槲皮素對XOD催化的尿酸和超氧陰離子自由基(O2-)的生成有可逆性抑制作用[8-9]。ARSHAD MEHMOOD等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在黃酮類化合物中木犀草素和黃芩素具有較強的抑制作用，黃酮醇類化合物中山奈酚、槲皮素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷具有抑制作用。尿酸轉(zhuǎn)運蛋白1(URAT1)是一種生理上重要的腎臟尿酸轉(zhuǎn)運蛋白，在尿酸鹽重吸收中起重要作用[11]。沈瑞明等[12]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過下調(diào)TLR/MyD88/NF-κB通路減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。YU TOYODA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素對URAT1具有強烈的抑制作用，能降低尿酸鹽相關(guān)疾病的風(fēng)險。

圖 6 KEGG通路富集分析結(jié)果

本研究將146個藥物-疾病交集基因構(gòu)建出PPI網(wǎng)絡(luò)，再根據(jù)CytoNCA功能篩選出了IL1B、IL6、TNF等12個核心基因。晶體相關(guān)的關(guān)節(jié)疾病通常與全身炎癥癥狀有關(guān)[14]。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)表明，高尿酸血癥的遺傳基礎(chǔ)是由含尿酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因座主導(dǎo)的，這些轉(zhuǎn)運蛋白參與了腎臟和腸道排泄尿酸鹽的過程；候選基因研究已經(jīng)檢測到編碼影響NLRP3(NOD-，LRR-和含吡啶多聚體-3)炎癥體的激活和活性的基因與痛風(fēng)的關(guān)聯(lián)[15]。白細胞介素-1β(IL1B)在痛風(fēng)的炎癥發(fā)生過程中起重要作用，并且已知在MSU晶體刺激后，從巨噬細胞中大量釋放[16]。內(nèi)源性細胞因子IL-6參與MSU介導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化和隨后的先天免疫細胞產(chǎn)生IL-1β，并且在MSU晶體誘導(dǎo)的滑膜炎癥中起關(guān)鍵作用。腫瘤壞死因子(TNF)在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，其機制包括誘導(dǎo)IL-1活化、增強白細胞介素-6(IL-6)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、激活核因子(NF-κB)炎癥信號通路、參與慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的骨骼破壞與侵蝕，以及與中性粒細胞的相互作用[17]。

本研究通過KEGG通路富集分析找到了與痛風(fēng)密切相關(guān)的信號通路，如IL-17信號通路、TNF信號通路、JAK-STAT信號通路、Th17細胞分化、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-kB信號通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、HIF-1信號通路等。這些通路在痛風(fēng)的炎癥發(fā)生以及代謝性障礙中起重要作用。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對消痛湯治療痛風(fēng)進行了分析，初步揭示了消痛湯治療痛風(fēng)的潛在活性成分、作用網(wǎng)絡(luò)和潛在作用機制，為進一步探討其發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供了研究方向，其后續(xù)研究尚需系統(tǒng)的靶點驗證和體內(nèi)外實驗，以證實其功效網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)和作用靶點集合。