基于譜效關系的白花敗醬草黃酮部位抗腸腫瘤活性成分篩選研究

周麗萍，韓 嘯，李曉晨，丁昕瑤，包永睿，李 鑫，趙 琳*

(1.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600；2.朝陽市檢驗檢測認證中心，遼寧 朝陽 122000)

白花敗醬草(Patriniavillosa(Thunb.)Juss.)始載于《神農本草經》，是敗醬科敗醬屬植物，其性味苦、寒、無毒，具清熱利濕、活血化瘀、清心安神等功效[1]，臨床上常用于治療潰瘍性結腸炎、慢性胃炎、腫瘤等疾病[2]。白花敗醬草主要含有黃酮類、皂苷類、酚酸類等多種成分，除抗炎、抗菌、鎮靜等藥理作用外還具有抗腫瘤活性，但其具體活性成分尚不清晰。中藥譜效關系研究是指將中藥指紋圖譜技術與藥效學相結合[3-6]，通過灰色關聯度分析[7]、神經網絡、偏最小二乘回歸分析[8-10]等系統揭示中藥藥效活性成分，為中藥的藥效物質研究起到了基礎性作用[11-12]。

本實驗采用CCK-8法測定白花敗醬草不同極性部位成分對人腸癌細胞Caco-2抑制作用，通過比較后發現白花敗醬草總黃酮純化物對腸癌細胞Caco-2的抑制作用最好。采用液質聯用技術，建立白花敗醬草總黃酮純化物總離子流圖譜，同時，通過灰色關聯分析及偏最小二乘回歸分析方法篩選白花敗醬草抗腸腫瘤活性成分[13]，為進一步探討白花敗醬草藥材的藥效活性物質配伍提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

Agilent 1290型快速高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；Agilent Q-TOF-MS質譜 (安捷倫科技有限公司)；酶標儀(瑞士TECAN公司)；冷凍離心儀(美國Thermo公司)；US AUTOFLOW型CO2培養箱(德國NUAIRE公司)。

1.2 試劑與藥材

質譜級甲醇、乙腈 (德國Merck KGaA公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；質譜級甲酸(美國Thermo公司，批號：141831A)；乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇 (天津市科密歐化學試劑有限公司)；胎牛血清(上海Excell Bio公司)；DMEM高糖培養基(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；EDTA (天津基準化學試劑有限公司)；青霉素(國藥集團藥業股份有限公司)；鏈霉素(大連美羅大藥廠)；碳酸氫鈉，氯化鈉，氯化鉀，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鈉均為分析級別。蘆丁(批號：18012310)；芹菜素(批號：17011701)；異葒草苷(批號：140329)；槲皮素(批號：17121531)；野黃芩苷(批號：17212722)；咖啡酸(批號：17122804)；綠原酸(批號：110753-200413)；阿魏酸(批號：17120702)；異牡荊苷(批號：130924)；木犀草素(批號：17120702)；金合歡素(批號：17102401)；對照品均購自成都普菲德生物技術有限公司，純度≥98%；敗醬草飲片(批號：20140501)，亳州市中亳中藥飲片廠，經遼寧中醫藥大學許亮教授鑒定為白花敗醬Patriniavillosa(Thunb).Juss.的干燥全草)。

1.3 細胞株

人腸癌細胞株Caco-2，購自大連美侖生物技術有限公司。

2 方法與結果

2.1 白花敗醬草提取液制備

稱取藥材適量，以15倍量，60%乙醇回流提取3次，放冷，濾過，合并提取液，回收乙醇至無醇味，加純水稀釋至濃度為0.1 g(生藥量)·mL-1溶液，備用。

2.1.1 不同極性白花敗醬草提取物的制備 量取100 mL白花敗醬草提取液，采用HPD-300樹脂進行純化，收集洗脫液，40 ℃真空旋蒸至濃稠，70 ℃水浴蒸干即得白花敗醬草總黃酮純化物[14]。精密稱取白花敗醬草總黃酮純化物5 mg，用甲醇定容至10 mL容量瓶內，過0.22 μm微孔濾膜，濃縮至10 mL，得到白花敗醬草總黃酮純化物溶液。

再分別量取5份100 mL白花敗醬草提取液，其中一份置于燒杯內，水浴濃縮至10 mL，其余4份分別置于分液漏斗中，各加入1∶1(v/v)的乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，輕輕振蕩搖勻，靜置分層，取上層溶液，水浴濃縮至10 mL。

上述6份濃縮液均置于-80 ℃ 冰箱內冷凍24 h，取出迅速轉移至預冷的凍干儀中，凍干24 h，分別得到白花敗醬草全成分、總黃酮純化物、乙醚層、二氯甲烷層、正丁醇層、乙酸乙酯層的凍干粉，備用。

2.2 白花敗醬草不同極性部位抗腸腫瘤體外藥效實驗

2.2.1 含藥培養基制備 精密稱定不同極性部位的白花敗醬草提取物，以含10%胎牛血清的DMEM培養基為溶劑制成濃度為1.0 mg·mL-1的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.2.2 Caco-2腫瘤細胞抑制試驗 取人腸癌細胞Caco-2細胞株，根據本實驗SOP規定，按常規貼壁細胞培養法，于DMEM高糖培養基中(含有10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素)，在溫度37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下進行常規培養，每2～3天換液1次。取處于對數生長期的人腸癌細胞Caco-2，經PBS清洗，胰酶消化后于細胞計數板計數，加培養液稀釋至細胞濃度為5×104個·mL-1。接種于96孔板，每孔各100 μL，待細胞密度增加至孔板面積的70 %左右時棄去上清液，分別設置給藥孔，空白孔(加細胞但不加藥物)，每組設置5個復孔。給藥孔加入含1.0 mg·mL-1敗醬草不同極性部位提取物的藥物培養液100 μL，繼續培養24 h后100 μL的10%CCK-8溶液，輕輕搖勻，于培養箱內培養4 h后置于酶標儀內檢測，波長為450 nm，記錄每孔吸光度A。

表1 不同極性部位敗醬草成分對人腸癌細胞 Caco-2抑制率

2.3 白花敗醬草總黃酮純化物圖譜的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent poroshell 120 SB-C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)，流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈：甲醇(95∶5)，梯度洗脫，0～20 min，5%～100%(B)，流速0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量0.8 μL。

2.3.2 質譜條件 電噴霧離子源(Dual AJS ESI)，采用正、負離子模式測定，毛細管電壓(Vcap)為4 000 V，干燥氣體溫度(Drying Gas Temp)為250 ℃，鞘氣溫度(Sheath Gas Temp)為350 ℃，干燥氣體流速(Drying Gas Flow)為13 L·min-1，鞘氣流速(Sheath Gas Flow)為11 L·min-1，霧化器壓力(Neulizer pressure)為45psig，碎裂電壓(Fragmentor)為125 V，質量范圍(Mass Range)為100～1 500m/z，碰撞能量20 eV，40 eV。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取白花敗醬草總黃酮純化物的凍干粉20 mg，置于10 mL量瓶內，甲醇超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.4 對照品溶液制備 精密稱取上述對照品各適量，分別置10 mL棕色量瓶內，加入甲醇溶解定容，制成每1 mL含有0.1 mg的溶液即得。

2.4 方法學考察

按“2.1”項下方法，“2.2”項下條件進行方法學考察，精密度、重復性和穩定性RSD值均小于3.0%，表明該方法可行。

2.5 主要色譜峰篩選

精密吸取白花敗醬草總黃酮純化物溶液0.8 μL，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，得到白花敗醬草黃酮部位組分圖譜，從色譜圖中篩選出分離度與對稱性較好的24個色譜峰，結果見圖1。

圖1 白花敗醬草黃酮部位總離子流

2.6 灰色關聯度分析

根據白花敗醬草總黃酮純化物的指紋圖譜，從中篩選出分離度較好的色譜峰。首先將影響整體行為的數據進行分列，以反映系統藥效行為特征的數據序列為參考數列，以影響系統藥效行為的因素數據序列(白花敗醬草黃酮部位提取物的不同峰面積經歸一化處理)為比較數列，即子系列。采用灰色關聯度分軟件(Grey ModeLing_V3.0)進行分析，根據灰色相對關聯度的計算公式進行計算，得出不同極性藥材色譜峰與體外藥效學評價指標之間的關聯系數，結果見表2。

表2 敗醬黃酮部位純化物的色譜峰峰面積以及關聯系數

2.7 偏最小二乘回歸分析

為了進一步明確白花敗醬草化學成分和藥效之間的相關性，本研究以歸一化后的24個主要色譜峰為自變量(X)，藥效數據為因變量(Y)，對 1.0 mg·mL-1給藥濃度時的數據進行偏最小二乘回歸分析(PLS)，所得擬合模型前5個潛在因子累計可以解釋自變量100%的信息，解釋因變量100%的信息，說明潛在因子的信息綜合解釋能力較好。回歸系數結果見圖2。1.0 mg·mL-1給藥濃度時得到方程：Y=0.139-0.081X1+0.039X2-0.025X3-0.000X4-0.052X5-0.026X6+0.06X7+0.008X8+0.020X9+0.085X10-0.026X11-0.002X12-0.026X13-0.024X14+0.052X15-0.047X16-0.031X17+0.053X18+0.013X19+0.012X20-0.051X21-0.006X22-0.009X23+0.085X24，其中回歸系數的正、負代表各成分對抗腸腫瘤的正相關或負相關，回歸系數絕對值越大，表明該自變量對癌細胞影響越大。綜合累積變量重要性結果，可見2、7、8、9、10、15、18、19、20、24號共10個色譜峰對藥效貢獻起到正向促進作用。

圖2 1.0 mg·mL-1 給藥濃度標準化回歸系數

3 討論

中藥所含化學成分種類繁多，基于譜效關系研究是最常用的方法之一。本實驗對白花敗醬草黃酮部位純化物開展抗腸腫瘤活性成分篩選研究，篩選出的24個化合物對腸

癌細胞Caco-2均具有一定的抑制作用。指紋圖譜與藥效灰色關聯度結果顯示，24個色譜峰與藥效的關聯度為0.639 8～0.965 7，表明各成分與藥效的關聯度相差不大，顯示白花敗醬草發揮抗腫瘤功效是其有效物質成分群共同作用的結果。相關系數大于0.8的色譜峰有9個，分別為7、10、15、18、19、20、21、22、24號色譜峰，相關排序為24t h>10 th>20 th>15 >18 th>7 th>19 th>22 th>21 th。從灰色關聯度分析的結果得出這9個活性成分對抑制腸癌細胞增殖起到重要的作用，進一步說明白花敗醬草發揮藥效是其多種成分共同作用的結果。同時應用偏最小二乘回歸分析法，按照回歸系數絕對值大小排序，可知各成分對腸癌細胞Caco-2抑制作用的影響由大到小依次為：峰 2、7、8、9、10、15、18、19、20、24。

通過兩種分析方法篩選色譜峰求交集，通過相關數據庫查詢以及文獻報道的方式，根據化合物分子量、碎片信息和裂解規律對以上篩選出的色譜峰進行化學成分解析，推測出7個化合物，并通過與對照品比對，確定了敗醬草黃酮部位純化物抗腸腫瘤活性較強的成分色譜峰分別為7(綠原酸)、10(咖啡酸)、15(野黃芩苷)、18(異葒草苷)、19(木犀草素)、20(異牡荊素)、24(芹菜素)。

本研究通過前期的白花敗醬草黃酮部位抑制結腸癌細胞株的初步篩選實驗，發現與其他人結腸癌細胞株比較，Caco-2細胞對白花敗醬黃酮部位純化物的敏感性較強，白花敗醬黃酮部位對Caco-2細胞的抑制作用較明顯，因此選用Caco-2細胞作為模型來研究白花敗醬黃酮部位抗腸腫瘤的作用機制。

本研究在對白花敗醬草樣品主要色譜峰進行指認的基礎上，明確了白花敗醬黃酮類成分抗腸腫瘤的活性成分。基于前期實驗室研究，分析其單一活性物質體內(外)入血成分抗腸腫瘤作用不顯著，說明中藥發揮治療作用具有多成分、多靶點特點，發揮藥效是其多種成分共同作用的結果。本實驗采用灰色關聯度分析和偏最小二乘回歸分析法進行譜效相關分析，表明白花敗醬草黃酮類有效組分群對藥效均有貢獻，只是每種成分貢獻率不同，進一步說明了白花敗醬草抗腸腫瘤作用是多成分協同作用的結果，揭示了白花敗醬草抗腸腫瘤作用的藥效物質(群)，該結果為基于白花敗醬草藥材安全有效的現代化抗腸腫瘤藥物開發、藥效保障及質量控制提供了一定的參考依據，并且為白花敗醬草的深入研究打下基礎。