BOX-Behnken響應面法優化崗松藥渣中葡萄糖的發酵工藝

尹 麗，梁海蓮，陸萬冰，盧海嘯

(玉林師范學院，廣西 玉林 537000)

崗松(BaeckeafrutescensL.)屬桃金娘科崗松屬植物，又名掃把枝、鐵掃把、香柴、石松草等[1]，在《廣西壯藥材質量標準匯編》有收載，全株均可入藥，具有化瘀止痛、清熱解毒、利尿通淋、殺蟲止癢的功效[2-5]，臨床可用于皮膚濕疹、淋病、瘙癢、疥瘡、腳癬、滴蟲行陰道炎等癥[6]。目前，我國對崗松利用大多處于“總提取物”形式的粗放狀態，在崗松提取過程中僅對崗松油等主要成分進行了提取加工，資源性化學成分或其他潛在利用價值并未得到有效挖掘和利用[7]。通常中藥渣還含有藥物成分和營養成分，如苷類、堿類、氨基酸、微量元素還剩余20%～30%，可收集中藥渣進行發酵，制作中藥渣發酵飼料[8]。跟普通飼料相比，其可提高動物的育肥效果、飼料利用率，降低藥物殘留、毒副作用。藥渣中殘留的活性成分還能起到防病治病，提高免疫力的效果，取代抗生素飼料添加劑，在防治動物疫病方面起重要作用[9]。本試驗旨在研究崗松藥渣資源化利用，以崗松藥渣為原料，利用Box-Behnken響應面法優化崗松藥渣發酵工藝，以葡萄糖含量作為響應值，考察發酵時間、發酵初始pH值和發酵溫度對葡萄糖含量的影響[10]，并優化發酵工藝，為中草藥下游產品開發和應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

崗松藥渣：由廣西源安堂藥業有限公司提供；GB/T20886-2007安琪高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；蛋白胨(生化試劑)：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖含量測試盒：上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 試驗儀器

WN-200多功能粉碎機：廣州市旭朗機械設備有限公司；LE403E電子分析天平：瑞士梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司；SpectraMax190酶標儀：美國MD公司；Eppendorf 5424R小型高速冷凍離心機：上海艾研生物科技有限公司；HH-S4數顯恒溫水浴鍋：常州國宇儀器制造有限公司；PHBJ-260型酸度計：成都紐思特檢測技術有限公司；HDPN-II-256電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；DHG-1012A型電熱恒溫鼓風干燥箱：河北星建儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌活化增殖[11]稱量7.0 g安琪高活性干酵母置于250 mL錐形瓶，加入100 mL溫水，分別加4%蛋白胨和4%葡萄糖，混勻后置于37 ℃恒溫培養箱中活化培養72 h后，取出備用。

1.3.2 崗松藥渣的單因素發酵實驗

(1)發酵溫度對葡萄糖含量的影響。崗松藥渣干燥粉碎后過40目篩，稱取6份崗松藥渣，每份10.0 g，置于錐形瓶中，將崗松藥渣按質量體積分數50 g/100 mL加入酵母增殖活化液，用1 mol/L的HCL將上述6份混合液pH值調至7.0，分別置于29 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃、45 ℃ 溫度下培養72 h，然后測定崗松藥渣發酵物葡萄糖含量。

(2)發酵pH值對葡萄糖含量的影響。崗松藥渣干燥粉碎后過40目篩，稱取6份崗松藥渣，每份10.0 g，置于錐形瓶中，將崗松藥渣按質量體積分數50 g/100 mL加入酵母增殖活化液，用1 mol/L的HCL分別將上述6份混合液pH調至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，置于37 ℃溫度下培養72 h，然后測定崗松藥渣發酵物葡萄糖含量。

(3)發酵時間對葡萄糖含量的影響。崗松藥渣干燥粉碎后過40目篩，稱取6份崗松藥渣，每份10.0 g，置于錐形瓶中，將崗松藥渣按質量體積分數50 g/100 mL加入酵母增殖活化液，用1 mol/L的HCL分別將上述6份混合液pH值調至7.0，置于37 ℃溫度下培養24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，然后測定崗松藥渣發酵物葡萄糖含量。

(4)響應面設計法優化定向生成崗松藥渣發酵條件[12]。以單因素試驗設計得到的結果為中心點，運用Design Expert 8.0.6軟件針對主要因素(發酵溫度、pH 值、發酵時間)使用中值組合重新編碼，以葡萄糖含量為響應值，采用Box-Benhnken中心組合實驗設計原理，設計三因素三水平的響應面實驗(見表1)。

表1 響應面因素與水平

表 2 Box-Behnken實驗設計方案及結果

1.3.3 葡萄糖含量測定 稱取崗松藥渣發酵物2.0 g置于試管中，加入蒸餾水10 mL，70 ℃水浴加熱溶解，過濾去除不溶物，離心后取上清液作為待測液，按葡萄糖測定試劑盒說明書(氧化酶法)測定，進行葡萄糖含量測定，計算每克發酵樣品中糖含量。

1.3.4 數據統計和分析 數據采用數據用軟件Graphpad prism 7進行數據統計分析并繪圖，用SPSS 19.0軟件對數據進行方差分析(ANOVA)，采用Design-Expert8.0.6軟件分析數據及繪圖。

2 結果與分析

2.1 最適發酵溫度的確定

由圖1可知，在控制發酵時間72 h和發酵pH=7.0條件下，隨著發酵溫度的升高，崗松藥渣發酵效果越來越好；當溫度升至37 ℃ 時發酵效果最好，葡萄糖含量達到最大值1.418 mg·g-1；溫度大于37 ℃ 后，葡萄糖含量隨著發酵溫度的升高而減少，總體來看，發酵溫度對葡萄糖含量影響不明顯(P>0.05)。在葡萄糖響應面試驗中，以發酵溫度37 ℃作為中心值。

注：圖中字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；下圖同。

2.2 最適發酵pH值的確定

由圖2可知，在控制發酵溫度為37 ℃、發酵時間為72 h條件下，當pH值小于7時，隨著pH值的增大，葡萄糖含量顯著增加(P<0.05)。這是因為酵母菌產生酵母多糖，在稀酸性條件下水解為葡萄糖；或是崗松藥渣經酵母菌產生各種分解酶作用，使殘留在崗松藥渣中的多糖溶出，多糖進一步水解為葡萄糖[13]。pH=7時，發酵液中葡萄糖含量最多，當pH值大于7后，隨著pH值的升高，葡萄糖含量顯著下降(P<0.05)，其原因可能是葡萄糖在堿性條件下加熱易分解。因此，在葡萄糖響應面試驗中，以發酵pH=7.0作為中心值。

圖2 pH值對葡萄糖含量的影響

2.3 最適發酵時間的確定

由圖3可知，在控制發酵溫度為37 ℃、發酵pH=7.0的條件下，當提取時間<72 h時，葡萄糖含量隨著提取時間的增加而增加(P<0.05)；當提取時間為72 h時，葡萄糖含量達到最大值1.546 mg·g-1；當提取時間>72 h，葡萄糖含量出現大幅度的降低(P<0.05)。這是因為時間過長，酵母菌株含量增多，對營養物質的需求也多，但發酵物中營養物質有限，生長到一定程度就不能滿足微生物的生長了，使菌株生長受到抑制。因此，在葡萄糖響應面試驗中，以發酵時間72 h作為中心值。

圖3 發酵時間對葡萄糖含量的影響

2.4 響應面優化實驗結果

本試驗采用Design-Expert 8.0.6對數據進行多元回歸擬合，以發酵溫度、發酵初始pH值、發酵時間為響應變量，以葡萄糖含量為響應值，通過對表2數據進行分析處理，得到關于葡萄糖含量的二次多項回歸模型方程：

Y=1.79-0.012A+0.057B-0.024C-0.002AB+0.008AC-0.037BC-0.34A2-0.15B2-0.21C2

用 Expert Design 8.0.6 軟件，應用回歸分析對方程和各因子進行方差分析，結果見表3。

由表3方差分析結果可知，模型F值為49.93，模型的決定系數R2=0.987 4，P<0.000 1，表明響應回歸模型達到了極顯著水平；失擬項P=0.538 1>0.05，失擬不顯著；表明該二次方程模型極顯著，回歸方程模型與實際試驗擬合性較好，模型校正決定系數RAdj2=0.913 0，表明91.3%的試驗數據的變異性可以用此回歸模型解釋，實驗誤差小，應用響應面法優化定向生成崗松藥渣中葡萄糖的發酵工藝是可行的，具有參考性。

表3 回歸方程方差分析

各因素對葡萄糖產率影響次序：發酵pH值>發酵時間>發酵溫度。根據回歸模型的方差分析來看，一次項的發酵pH值達極顯著水平，發酵時間達顯著水平；因素間的交互作用只有BC顯著影響發酵物葡萄糖的含量。AB、AC間的交互作用對崗松藥渣發酵物葡萄糖含量影響不明顯；二次項的發酵溫度達顯著水平，發酵pH值、發酵時間達極顯著水平。

2.5 響應面分析圖

根據各因素之間的交互作用及回歸方程，作出響應面分析圖，見圖4-圖6。圖中等高線可以直觀反映兩因素之間關系。圖形坡度大、顏色變化快表示試驗結果顯著，反之則不顯著；等高線形狀表示兩因素之間交互作用情況，橢圓形表示兩因素之間影響顯著，圓形則表示不顯著[14-15]。分析發酵溫度、pH值、發酵時間這3個因素的交互作用影響，結果顯示3個因素交互作用顯著。

圖4 pH值和溫度對葡萄糖含量影響的等高線和響應面

圖5 時間和溫度對葡萄糖含量影響的等高線和響應面

圖6 時間和pH值對葡萄糖含量影響的等高線和響應面

2.6 驗證試驗

通過響應面優化實驗，回歸模型預測的定向生成葡萄糖的最佳發酵工藝條件：發酵溫度為36.21 ℃，發酵pH=7.2，發酵時間為70.12 h。考慮到實際操作可行性，實際工藝為發酵溫度為36 ℃，發酵pH=7.2，發酵時間為70 h。在此條件下，重復進行3次平行驗證實驗，葡萄糖的平均含量為1.712 mg·g-1(RSD=1.73%，n=3)，與模型預測值1.728 mg·g-1無明顯差異。對比優化前的初始發酵液葡萄糖產量1.546 mg·g-1，提高了10.7%。

3 討論

中國農業農村部發布《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案(2018獸用抗菌年)》規劃2020年底前禁止藥物飼料添加劑濫用，養殖端濫用抗生素和違法使用藥物飼料添加劑的危害已獲得人們共識[16]，開發與推廣無抗生素綠色飼料添加劑逐漸受到重視和關注。目前崗松被廣泛應用，含有崗松有效成分的藥渣卻多被廢棄，造成巨大的資源浪費[17-18]，如將其作為牲畜飼料的添加劑，具有無殘留、無抗藥性、經濟環保等優點，是一種新興的飼料添加劑[19-20]。

飼料中添加糖分能夠為乳酸菌提供發酵底物，使其迅速繁殖迅速產生乳酸，降低飼料pH值，進而抑制有害微生物增殖，達到飼料長期保存的目的[21-22]。本研究以葡萄糖含量作為飼料發酵品質的評價指標，量化工藝參數，通過 Box-Behnken 中心組合設計多因子響應面試驗研究分別建立定向生成葡萄糖工藝路線，通過單因素和響應面優化試驗綜合分析，可知影響葡萄糖得率的因素為發酵pH值>發酵時間>發酵溫度。發酵工藝采用非線性模型擬合，可信度較好，具有良好預測性。本試驗所采用的設備及原料成本低廉、操作安全、方法簡便易行、效果好。禁抗時代到來，崗松藥渣中葡萄糖新發酵工藝為崗松藥渣資源化利用提供了理論依據與技術參考。